张涛，牟英玉，亓王盼，郭长征，张继友，毛胜勇

（南京农业大学消化道微生物研究室，南京农业大学反刍动物营养与饲料工程中心，南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095）

奶牛亚急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）是由于奶牛长期采食过量易发酵碳水化合物，导致瘤胃内微生物产酸速率大于酸的移除速率，造成瘤胃内挥发性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）积累，最终使瘤胃 pH 值长期处于 5.2～5.8 的一种营养代谢疾病［1］，当奶牛瘤胃 pH＜5.8 持续时间超过 330 min·d−1，将其定义为SARA［2］。SARA 可导致瘤胃代谢紊乱、瘤胃内环境稳态被破坏，并诱发瘤胃上皮炎症等疾病，最终严重危害动物的机体健康，并降低其生产性能，给奶牛养殖带来巨大的经济损失。在实际生产中，养殖者常通过配方调整、添加碳酸氢钠等缓冲剂或酵母培养物等微生态制剂来降低SARA 的发生率，但尽管如此，规模化牧场中泌乳早期和中期奶牛SARA 的发生率依然在19%～26%［3］。这些结果说明，SARA 的发生除与日粮结构有关外，还与其他因素有关。近年来一些研究结果显示，在高精料饲喂条件下，奶牛的瘤胃pH 值下降幅度明显不一致，部分奶牛的瘤胃pH 值下降幅度较大，部分则较小，两者发生SARA 的严重程度不一，这表明奶牛对SARA 的耐受性存在较大的个体差异［4−5］。此外，绵羊和肉牛个体间也存在 SARA 耐受性差异［6−7］。综上所述，反刍动物对 SARA 的耐受性存在个体差异可能是一种普遍现象，但隐藏在这一表象背后的生物学机制目前并不十分清楚。

代谢组学是一门研究生物系统全部代谢物组成及其动态变化规律的科学，通过对内源性小分子代谢物（相对分子质量＜1500）进行定性或定量分析，其能反映机体在健康或疾病状态下代谢活动的变化，因而对于临床症状出现前的动物生理状态的评估具有重要意义［8］。目前，代谢组学技术已广泛运用于药理学、病理学和毒理学等领域［9−10］。近年来，研究者们利用代谢组学技术分析了奶牛瘤胃及血液代谢组的组成，发现SARA 的发生会造成奶牛瘤胃液中生物胺的浓度显著增加，且血浆中代谢产物发生显著改变［11］。然而，目前尚不清楚对SARA 易感性不同的奶牛血浆和牛乳中代谢物的差异，以及其与SARA 易感程度间的内在关系。

本研究中，拟在相同饲喂条件下，筛选出对SARA 耐受性存在显著差异的奶牛，利用代谢组学技术，同时结合气相色谱分析手段，比较研究两组奶牛血液和乳中脂肪酸及其他代谢物的组成差异，以期筛选出与SARA 耐受性相关的标志物，为奶牛健康养殖及分群饲养提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及动物饲养管理

本试验选用12 头体重相近且装有永久性瘤胃瘘管的泌乳中期荷斯坦奶牛［2～3 胎，泌乳天数（114±22）d］，栓系饲喂系统，自由采食和饮水。试验期为35 d，前14 d 为日粮适应期，后21 d 为试验期，试验期提供精粗比为4∶6 的混合饲粮，饲粮配方及营养水平见表1。分别于每天8：00 和19：00 饲喂，剩料量控制在饲喂量的5%～10%，并于饲喂前挤奶。

表1 饲粮组成及其营养水平Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis）

1.2 样品采集

在试验期的第 20 和 21 天晨饲后 0、2、4、6、8、12 h 测定瘤胃 pH，基于瘤胃 pH 变化情况，进行奶牛分组；在 21 d的早晚收集乳样，按两次产奶量的比例进行等比混合，并取5 mL 奶样，冻存于液氮中，用于乳脂肪酸组成测定及代谢组学分析；于试验期的第21 天晨饲后6 h，通过颈静脉采集血液，制备血浆，用于血浆脂肪酸组成测定及代谢组学分析。

1.3 血浆及乳脂肪酸组成测定

1.3.1 试剂配制 内标液：称取20 mg 十九烷酸甲酯（Sigma H4515，德国），用正己烷定容至100 mL；氯仿/甲醇/2，6-二叔丁基对甲苯（BHT）：氯仿300 mL，甲醇 200 mL，BHT 50 mg；氢氧化钾/甲醇溶液：28 g 氢氧化钾，用甲醇定容至 1 L；HIP 溶液：600 mL 正己烷，400 mL 异丙醇，50 mL BHT；甲酯化试剂：1.75 mL 甲醇，0.40 mL 甲醇钠（Sigma 403067，德国）；终止试剂：称取 1 g 草酸溶于 30 mL 乙醚中；标准品溶液：将 C4～C24混标（Sigma 18919，德国）溶于1 mL 正己烷中。

1.3.2 血浆及乳中脂肪酸提取及甲酯化 血浆中脂肪酸提取及甲酯化参照Sun 等［13］的研究方法。乳中脂肪酸抽提及甲酯化参照王小静等［14］的研究方法。

1.3.3 气相色谱分析条件 采用Agilent 7890A 气相色谱仪（美国），Agilent G4513A 自动进样器（美国），CP-sil-88 脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.20 μm，Agilent，美国）。程序升温条件参照杨炳壮等［15］的研究方法。

1.4 液相色谱−质谱联用（liquid chromatography−mass spectrometry，LC−MS）代谢组学分析

1.4.1 血浆及乳样品预处理 吸取100 μL 血浆或牛乳样本于1.5 mL EP 管中；加入300 μL 甲醇，并加入10 μL 内标液（2.8 mg·mL−1，2-氯苯丙氨酸）；涡旋 30 s，−20 ℃静置 1 h；置于 4 ℃离心机中，13000 r·min−1离心 15 min；吸取 200 μL 上清液，装瓶待测。

1.4.2 LC−MS 鉴定条件 采用LC−MS（Thermo，Ultimate 3000LC，Q Exactive，德国）仪器分析平台，C18色谱柱［Hyper gold C18（100 m×2.1 mm×1.9 μm）］进行鉴定。色谱分离条件：柱温为40 ℃；流速0.3 mL·min−1；流动相组成A：水+5%乙腈+0.1%甲酸，B：乙腈+0.1%甲酸；进样量为10 μL，自动进样器温度为4 ℃；流动相梯度洗脱程序参考表2。

表2 流动相洗脱程序Table 2 The mobile phase elution procedure

质谱参数正模式：加热器温度：300 ℃；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.0 KV；毛细管温度：350 ℃；离子透镜电压（SLens RF Level）：30%；负模式：加热器温度：300 ℃；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.2 KV；毛细管温度：350 ℃；S-Lens RF Level：60%。

1.5 数据分析

采用SPSS 26.0 软件的独立样本t检验分析血浆和牛奶中脂肪酸组成数据，P＜0.05 表示差异显著。应用 Compound Discoverer 软件（Thermo）对LC−MS检测数据进行提取和预处理，并通过SIMCA-P 软件v.13.0（Umetrics，Umea，Sweden）对数据进行多位统计分析。 使用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS−DA）预测样品间的相互关系，并描述测得变量对模型的贡献度的数值VIP（variable importance in the projection）。通过非参数（Mann-Whitney）检验获得目标代谢物的P值，并将 VIP＞1 和P＜0.05作为筛选差异代谢物的条件。使用MetaboAnalyst Web（http：//www.metaboanalyst.ca）对差异代谢产物进行差异倍数（fold change，FC）及代谢通路富集分析（pathway analysis）。

2 结果与分析

如图1 所示，在相同日粮下，两组奶牛瘤胃pH 发生了明显的变异。本试验将瘤胃pH 平均值最高（pH=6.11，n=4）和最低（pH=5.76，n=4）的奶牛分为耐受组（tolerant，TOL）和易感组（susceptible，SUS）。

图1 奶牛晨饲后12 h 内瘤胃pH 变化Fig. 1 The change in rumen pH within 12 h after morning feeding of dairy cows（mean±SEM，n=4）

2.1 血浆及牛奶脂肪酸组成

由表3 可知，与TOL 组相比，SUS 组奶牛血浆中C16：0、C17：1、C18：0、C18：2n6t、C18：3n3、C24：1及≤C16：0 的脂肪酸比例显著较高（P＜0.05），而C6：0、C20：0、C20：1 及 C20：4n6 脂肪酸的比例显著降低（P＜0.05）。如表 4 所示，与 TOL 组比较，SUS 组奶牛乳中的 C10：0、C11：0 和 C12：0 脂肪酸含量显著升高（P＜0.05），同时也显著增加了碳链长度≤C16：0 脂肪酸的含量（P＜0.05），而 C16：0、C16：1、C18：0、反 9 C18：1（C18：1n9t）、顺 9 C18：1（C18：1n9c）、饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）、单 不 饱 和 脂 肪 酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）及碳链长度＞C16：0 的脂肪酸含量显著降低（P＜0.05）。

表3 血浆中脂肪酸的组成Table 3 The fatty acid composition in the plasma of the dairy cows（%，n=4）

表4 牛奶中脂肪酸的组成Table 4 The fatty acid composition in the milk of the dairy cows（g·100 g-1，n=4）

2.2 LC−MS 化合物的鉴定和定量

2.2.1 血浆代谢物鉴定及分析 血浆正模式（ESI+）和负模式（ESI−）中分别鉴定出140 和108 个有效代谢物，除去正、负离子模式中重复测得的代谢物后，共得到208 种不同的小分子代谢物。使用PLS−DA 模型对两组样品进行分析，其 ESI+模式下Y轴方向模型的累积解释率（R2Y）=0.950，模型的累积预测率（Q2）=0.705，ESI−模式下R2Y=0.981，Q2=0.561，表明模型的可解释度与预测能力良好，SUS 与TOL 组奶牛样品表现出明显分离，表明两组血浆代谢物组成差异明显。

以 VIP＞1，P＜0.05 为筛选条件，共筛选出 8 个差异代谢产物（表 5）。与 TOL 组奶牛相比，SUS 组 L-苯丙氨酸水平显著降低（P＜0.05），而MG（18：0/0：0/0：0）、9-HODE、12（13）Ep-9-KODE、烟酰胺、异戊基肉碱、磷酸肌酸及L-谷氨酸水平显著升高（P＜0.05）。代谢通路富集分析显示，这些差异代谢物主要富集在氨基酸的生物合成与代谢及氮代谢等10 条代谢途径中。

表5 SUS 和TOL 组奶牛血浆中差异代谢物变化Table 5 The changes of plasma different metabolites between susceptible and tolerant cows（n=4）

2.2.2 牛奶代谢物鉴定及分析 在正、负离子模式下，分别鉴定出116 和108 种小分子化合物，去除重复值共鉴定出188 种代谢物。PCA 分析结果显示，两组牛奶样品并没有区分开。使用PLS−DA 模型对两组样品进行分析，其 ESI+模式下R2Y=0.883，Q2=0.728，ESI−模式下R2Y=0.997，Q2=0.895，表明模型的可解释度与预测能力良好，SUS 与TOL 组奶牛样品表现出明显分离，表明两组奶牛乳中的小分子化合物组成有明显差异。

以VIP＞1，P＜0.05 为筛选条件，共筛选出16 个差异代谢产物，主要为脂质、有机酸、糖类及其衍生物及核苷类等物质（表6）。与TOL 组奶牛相比，除1-硬脂酰甘油磷酸丝氨酸和鞘氨醇水平在SUS 组奶牛乳中的含量较高外（P＜0.05），其余14 种化合物的含量均显著降低（P＜0.05）。这些差异代谢物主要参与脂质代谢、泛酸与辅酶A 生物合成及核苷酸代谢等途径，其中甘油磷脂代谢途径在SUS 奶牛中显著下调（P＜0.05）。

表6 SUS 和TOL 组奶牛乳中差异代谢物变化Table 6 The change of milk different metabolites between susceptible and tolerant cows（n=4）

3 讨论

本试验应用气相色谱分析（gas chromatography，GC）和LC−MS 技术，比较研究了奶牛血浆及奶中的脂肪酸组成和代谢产物差异，旨在探究对亚急性瘤胃酸中毒耐受性不同的奶牛的机体代谢及乳腺代谢的变异性，为奶牛的健康养殖提供理论依据。

3.1 血浆中脂肪酸变化

奶牛肠道中的脂肪酸主要来源于日粮中的过瘤胃脂肪酸、瘤胃微生物细胞壁中的脂肪酸和瘤胃微生物降解日粮脂肪过程中形成的脂肪酸［16］。这些肠道脂肪酸部分在小肠黏膜细胞内形成乳糜微粒，而后通过淋巴系统进入血液［17］，部分被吸收进入肝脏，在肝脏中形成极低密度脂蛋白胆固醇，并分泌到血液中［18］。血液中这些脂肪酸与载体蛋白结合，进而形成可以被乳腺摄取的脂蛋白。由此可见，血液是日粮脂肪酸向乳脂肪酸转变的重要枢纽和通道。本研究中发现两组奶牛的饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）及多不饱和脂肪酸（PUFA）的比例均没有发生变化，但在SUS 组中，碳链长度≤C16：0 的脂肪酸的比例显著升高。碳链长度≤C16：0 的脂肪酸主要由短链脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）和中链脂肪酸（middle chain fatty acid，MCFA）组成，SCFA 和MCFA 主要通过小肠黏膜细胞吸收，经肝门静脉进入血液。赵小伟等［19］的研究结果发现，日粮中添加SCFA 和MCFA 可显著提高奶牛血液中碳链长度≤C16：0 的脂肪酸含量，这一结果说明SUS 组奶牛血浆中碳链长度≤C16：0 的脂肪酸的比例增加可能与瘤胃内的SCFA 和MCFA 浓度有关。同时本研究发现，与TOL 组奶牛相比，SUS 组奶牛血浆中硬脂酸（C18：0）的比例显著升高。日粮中不饱和脂肪酸进入瘤胃后在微生物氢化作用下，最终产物为硬脂酸，因此奶牛血浆中硬脂酸的比例增加与瘤胃中微生物氢化作用密切相关。但据Latham 等［20］报道，在高精料日粮下，瘤胃pH 下降不利于主要的瘤胃氢化菌−溶纤维丁酸弧菌的生长，从而抑制瘤胃不饱和脂肪酸的氢化过程。Li 等［21］的研究也发现，对SARA 易感的牛群瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的相对丰度降低，瘤胃氢化作用减弱。因此，本研究中SUS 组奶牛血浆中硬脂酸的比例增加这一现象有待进一步研究。

3.2 牛奶中脂肪酸变化

奶牛乳脂中的脂肪酸来源主要有两种途径，4～16 碳脂肪酸和50%的C16 在乳腺中通过乳腺上皮细胞以乙酸和少量的β-羟基丁酸为基础从头合成［22］，而大于16 碳的长链脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）和其余的50%的C16 则来源于血液中循环的脂肪酸［23］。内源合成脂肪酸占总脂肪酸的40%～45%，血液转运直接吸收的脂肪酸占总脂肪酸的55%～60%。在本研究中发现SUS 组奶牛中的C12：0 和≤C16 的短中链脂肪酸含量显著升高，说明SUS 组奶牛乳腺中从头合成脂肪酸的能力较TOL 组奶牛强。有趣的是，本研究发现，尽管SUS 组奶牛血浆中的C16：0 和C18：0 的比例显著较高，但牛乳中检测到的C16：0 及C18：0 的含量却显著低于TOL 组奶牛。有报道显示，受到SARA 影响的奶牛血液中的总蛋白及低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）浓度会显著下降，从而降低了乳腺对血液中LCFA 的摄取［24］。SUS 组奶牛的血液中C16：0 及C18：0 的含量较低，可能也与此相关。同时本研究发现，SUS 组奶牛乳中的 C18：1n9t、C18：1n9c、MUFA 以及碳链长度＞C16：0 的长链脂肪酸含量显著较低。在 Kara［25］的研究中，奶牛发生 SARA 会导致乳中 MUFA 和 PUFA 含量下降，而 Xu 等［26］也在类似的研究中发现，SARA 会引起乳中LCFA 的含量下降，本研究结果与此一致。综上，与TOL 组奶牛相比，SUS 组奶牛乳腺组织增强了乳脂从头合成能力，而直接从血液中摄取LCFA 的含量降低，这与奶牛的机体健康及血浆中LCFA 的含量下降有关。

3.3 血浆代谢比较

血浆代谢物组成是动物机体代谢的整体表现，是评价动物机体健康及生理状态的重要靶标物。本试验中，对血浆中筛选的差异代谢物进行代谢通路分析显示，这些物质显著富集到10 条代谢通路中，其中大多与氨基酸代谢相关，包括精氨酸合成、组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等。对这些差异代谢通路进一步注释发现，精氨酸合成、组氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等代谢途径的变化，主要体现在L-谷氨酸的水平差异。L-谷氨酸是合成谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸和赖氨酸几种条件性必需氨基酸的重要前体物质。Zhang 等［27］研究发现，饲喂高精料日粮时，奶牛瘤胃pH 值显著下降，L-谷氨酸水平显著升高，氨基酸代谢活动显著加强。本试验中，SUS 奶牛血浆内L-谷氨酸水平显著上调了6.79 倍，推测SUS 奶牛血浆内L-谷氨酸水平升高与低瘤胃pH 值下瘤胃中微生物氨基酸代谢活动增强有关。此外，在精氨酸、组氨酸等氨基酸代谢过程中会产生与之相对应的生物胺，如精胺、亚精胺和组胺等［11］。机体内适当的生物胺浓度有利于维持内脏功能及免疫系统的代谢活性［28］，但高浓度生物胺损害奶牛肠道功能，导致奶牛发生疾病［29］。因此，SUS 组奶牛体内氨基酸代谢活动增强，亦可能促进生物胺的释放，进而损害机体健康。此外，SUS 组奶牛血浆中异戊酰基肉碱和磷酸肌酸的水平分别上调了1.86 和75.60 倍。一些研究发现，肉碱在血液中的游离脂肪酸进入线粒体氧化分解过程中起着重要作用［30］，SUS 组奶牛血浆中异戊酰基肉碱水平的升高，说明其可能促进更多游离脂肪酸进入线粒体氧化供能。研究表明，磷酸肌酸是一种重要的高能磷酸化合物，是高能磷酸基的短期储存形式，与机体的能量代谢关系密切［31−32］。SUS 组磷酸肌酸的水平显著较高，暗示其能量代谢更为活跃。此外，检测到SUS 组奶牛血浆中L-苯丙氨酸浓度显著较低。L-苯丙氨酸是机体发生炎症反应后免疫应答的潜在标志物，在Yang 等［33］的研究中，奶牛经历SARA 后，血液中的L-苯丙氨酸浓度显著增加，本研究结果与此不尽相同，故SUS 组奶牛血浆中L-苯丙氨酸浓度下降的原因还有待进一步的研究。综上结果表明，SUS 组奶牛体内的氨基酸和能量代谢活动较强，并可能刺激生物胺释放，损害胃肠道健康。

3.4 牛奶代谢比较

此前，已有研究利用代谢组学技术比较发生亚急性瘤胃酸中毒奶牛的乳中代谢物变化，发现发生SARA 的奶牛的乳代谢产物与正常奶牛有显著差异［34］。在本研究中发现SUS 组奶牛乳中甘油酸磷脂乙醇胺、3-磷酸甘油及肌苷2'，3'-环磷酸酯水平显著降低。磷脂是牛奶中一类重要的乳化剂和表面活性剂，它和蛋白质都是牛奶中脂肪滴膜的主要成分，约占奶牛乳脂的0.5%～1.0%［35］。SUS 组奶牛较低的磷脂水平暗示其乳腺的乳脂合成能力减弱，在此前的研究中也发现，SARA 易感奶牛的乳脂合成受到抑制，乳脂率较耐受奶牛下降18%［36］。本研究还发现，SUS 组牛奶中乳清酸及尿酸等5 种有机酸的含量显著较低，在这5 种有机酸中，乳清酸是牛奶中一类常见的物质，在蛋白质合成、糖类及脂类物质代谢中都起着非常重要的作用［37］。而尿酸是一类嘌呤核苷酸代谢产物［38］，在此前的研究中表明，奶牛泌乳量与奶中尿酸含量成线性正相关［39］。尽管在本试验中两组奶牛的泌乳量因个体差异较大并未表现出差异，但在Jing 等［40］的研究结果中，SUS 组奶牛泌乳量相较于TOL 组奶牛下降了15.6%。综上，本研究中两组奶牛乳中代谢物组成变化暗示其SUS 组奶牛乳脂合成能力可能下降，与此同时乳中磷脂、乳清酸等营养成分含量显著降低，乳品质发生改变。

4 结论

综上所述，本研究结果显示，SARA 耐受性不同的奶牛的血浆和乳中脂肪酸及代谢物组成存在较大差异。较TOL 组奶牛相比，SUS 组奶牛血液中脂肪酸及代谢物组成发生变化，氨基酸代谢活动较强，SUS 组奶牛乳腺的乳脂从头合成能力较强，而从血液中摄取长链脂肪酸能力减弱，与此同时，SUS 组牛群乳中磷脂、乳清酸等营养物质水平下降，乳品质下降。