张荣琴，万效琰，张晋豪，代真林，郑建立，崔兴国，赵项武，魏兰芳，姬广海

（1云南农业大学/农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室，昆明 650201；2云南省红河热带农业科学研究所，云南河口 661300；3曲靖佳沃现代农业有限公司，云南曲靖 655000）

0 引言

蓝莓(Vaccinium spp.)又称越桔，属杜鹃花科越桔属灌木，分布在热带、亚热带、温带等地区。蓝莓果实风味独特，营养丰富，具有较高的经济价值和广阔的栽培前景[1]。近年来，蓝莓在云南省的种植面积逐年增加，各种蓝莓病害也频繁发生[2]，其中蓝莓根癌病是一种为害蓝莓根部的重要病害，使蓝莓产量急剧下降，经济损失严重。根癌病是一种普遍发生的细菌性病害，由具有致瘤性的根瘤菌科菌株引起，包括土壤杆菌属、异根瘤菌属和根瘤菌属的多个种，可侵染多种果树和一些多年生观赏植物[3]，危害根颈、主根、侧根[4]，为果园及苗圃带来重大经济损失。2010年，阿根廷首次发现和报道了由根癌农杆菌引起的蓝莓根癌病[5]，同年国内研究人员在辽宁、吉林、山东及黑龙江省发现了蓝莓根癌病[6]，目前未见云南省蓝莓根癌病的研究报道。为阐明云南省发生的蓝莓根癌病病原菌种类，笔者采用多点采样，进行病原菌分离培养、致病性测定和病原菌的系统鉴定，以期为蓝莓根癌病的研究和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

蓝莓根癌病样品分别采集自云南省蓝莓主栽区曲靖市麒麟区、马龙区，玉溪市澄江县，昆明市石林县蓝莓基地发病地块。采集具有根癌病病症的根部肿瘤组织，保存于纸质采样袋中。

1.2 菌株分离和培养

参照文献[7-8]中根癌菌的分离方法。选取根部肿瘤组织白色幼嫩部分，清洗干净后用75%乙醇表面消毒60 s，再用无菌水漂洗3次，用无菌研钵将组织研碎，转移至无菌三角瓶中，加入45 mL无菌水，28℃160 r/min振荡30 min，将上清液梯度稀释(10-1～10-5)，各取100 μL在YEM和MW培养基按低浓度至高浓度进行涂布分离，28℃培养48 h。参考文献[9]中根癌土壤杆菌代表菌株的菌落特征和生物学特性测定方法，筛选具有根癌土壤杆菌特征的单菌落，纯化培养2代后保存备用（表1）。

表1 蓝莓根部肿瘤中分离获得的菌株

1.3 致病性测定

1.3.1 向日葵、番茄接种试验 选取向日葵和番茄为指示植物[10]。将分离得到的20株纯培养菌株（表1）分别接种到50 mL KB液体培养基中，28℃过夜培养，制备浓度为1×109CFU/mL的菌悬液。采用针刺法接种健康向日葵和番茄植株的茎基部并用脱脂棉保湿，对照用无菌水接种处理，每个处理5个重复。每天观察植株发病情况，2周后开始观察并记录肿瘤的生长情况。根据柯赫氏法则对发病部位进行再分离，根据菌株的形态特征判断分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。

1.3.2 蓝莓回接试验 选取致病性较强的菌株回接蓝莓。菌悬液制备方法同1.3.1，灌根生长健壮的蓝莓植株，对照用无菌水灌根处理，每个处理5个重复。每天观察植株发病情况，30天后开始观察记录肿瘤的生长情况。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定

1.4.1 病原菌DNA的提取 将供试菌株L-11、2JK11（芽孢杆菌）、1-BT-186（假单胞菌）、1-BT-22（冬青节杆菌）、2-BT-19（黄杆菌）、RG-4（根瘤菌）接种至NA培养基，28℃培养24 h，用接种环挑取少量菌体接种于LB液体培养基，28℃160 r/min过夜培养后收集菌体。按照细菌DNA提取试剂盒（天根DP302-02）说明书提取细菌基因组DNA。

1.4.2 16S rDNA序列分析及其同源性比较 根据已发表的细菌16S rDNA通用引物[11]27F和1492R对供试菌株进行PCR扩增，引物序列为27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)/1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。 参 照 Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反应体系，PCR扩增程序为：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min；扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。将得到的16S rDNA序列与BLAST中的分析结果进行比较，使用MEGA6.0构建系统发育进化树。

1.4.3 特异性引物设计及检测 将根癌土壤杆菌的ipt基因在BLAST中进行同源性比对并将靶片段序列通过BLASTn进行同源性比对，设计出特异性较强的蓝莓根癌病菌特异性引物[12-14]，由昆明擎科生物技术公司合成。引物序列为AtP3F(5’-GCAACGAGTTAGCAGAC GAG-3’)/AtP3R(5’-CCCATCGATCCCTTCCAGTA-3’)，预期片段为155bp。

利用AtP3F/AtP3R对菌株L-11和5株非靶标菌株2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4进行PCR扩增。参照Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反应体系，PCR扩增程序同1.4.2，扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.5 Biolog生理生化特性测定

采用美国BIOLOG公司的MicrostationTMV 4.01系统、革兰氏阴性菌微板(GN)和数据库，Biolog-GN板反应底物如表2，试验程序按公司的操作指南进行。将供试菌株L-11在YEM培养基上转接2次，划线接种到Bug琼脂培养基上，28℃培养24 h，用无菌棉签轻轻擦拭培养基上的菌落，移入无菌稀释缓冲液中，混匀得到菌悬液，测定其浊度为98%。用移液器将菌悬液加入GN微孔板，每孔150 μL，共96孔，对照孔加150 μL无菌水，置于28℃培养，4、24、48 h后读数记录结果。

表2 Biolog GN微孔板上96种碳氮源底物

1.6 田间药剂筛选

1.6.1 供试蓝莓 试验蓝莓园位于曲靖市麒麟区越州镇大梨树村，试验于2018年12月开始、2019年5月结束。

1.6.2 供试药剂 化学药剂包括50%氯溴异氰尿酸粉剂（南京南农农药科技发展有限公司），1.5%噻霉酮水乳剂（陕西西大华特科技实业有限公司），1%申嗪霉素悬浮剂（上海农乐生物制品有限公司），叶斑宁-60亿芽孢/mL解淀粉芽孢杆菌Lx-11水剂（江苏苏科农化有限公司）。生防菌剂为WR13-6、C3、13-6、枯草芽孢杆菌，均由本实验室提供。

1.6.3 试验方法

（1）药剂施用方法。选择基地中发病严重的蓝莓植株进行药剂试验，共9个处理（8个药剂处理，1个空白处理），每个处理30株蓝莓，供试药剂稀释至相应浓度（表3），每隔10天灌根1次，每株每次灌1000 mL，共灌根5次。

表3 药剂施用浓度

（2）试验结果调查及统计方法。

①坐果率调查。花期结束后每隔15天调查1次坐果情况，直至果实子房膨大成形不再出现生理落果为止。

②田间药剂防效评估。最后一次灌根10天后进行病情调查。每个小区随机选取5株蓝莓进行调查，3次生物学重复，依据根瘤情况进行分级（表4），按照式(2)～(4)计算各处理的发病率、病情指数以及防效。

表4 根癌病分级标准

式中，A为试验区处理后的病情指数，B为试验区处理前的病情指数，C为对照区处理后的病情指数，D为对照区处理前的病情指数。

2 结果与分析

2.1 田间症状

蓝莓根部肿瘤早期呈圆形、黄白色，后期瘤体慢慢变大，并由黄褐色变为暗褐色。根部肿瘤倾向于木质化，表皮粗糙，近圆形或不规则，直径可达2～3 cm，严重可达10～15 cm。田间调查发现，根癌发病早期在苗木根部形成较小的白色或者肉色粗糙瘤状物（图1D）。感染根癌病后，植物根部吸收水分及营养物质受阻，根系发育不良；发病后期，植株生长缓慢，叶片变黄、干枯甚至整株死亡[12]。

图1 田间蓝莓发病症状

2.2 致病性测定

2.2.1 向日葵、番茄接种试验 20株供试菌株接种向日葵幼苗2周后，接种P2-2、L-3、L-11、L-5的向日葵在茎基部开始出现不规则的瘤状突起，接种其他菌株的向日葵和对照无瘤状突起（图2A）；接种30天后，瘤状突起逐渐增大形成明显肿瘤，接种L-11的植株瘤状突起最大，其余16株菌株和对照仍无瘤状突起。L-11接种番茄幼苗14天后，接种部位出现瘤状突起（图2B）。从接种发病部位重新分离病原菌获得纯培养物，通过菌株形态学特征判断分离得到的病菌与原接种菌株相同。

图2 L-11致病性检测

2.2.2 蓝莓植株回接试验 L-11灌根蓝莓60天后，在接种植株根部形成不规则的结节状突起，对照植株的接种部位无瘤状突起。90天后瘤状突起逐渐增大，形成明显的冠瘿瘤（图3B），对照植株无肿瘤形成（图3A）。

图3 L-11接种蓝莓幼苗的症状

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 Biolog生理生化鉴定 将L-11菌悬液接种到Biolog革兰氏阴性菌微孔板(GN)中，4、24、48 h后分别测定其对碳、氮源的利用情况并与数据库中的标准菌株进行比较。L-11与数据库中的放射根瘤菌/土壤杆菌属(Rhizobium radiobacter/Agrobacetrum sp.)相似程度较高（表5），碳源、氮源利用情况完全相同，均不能利用亚甲基丁二酸(E2)、α-氧代戊酸(E5)、D-丝氨酸(G8)。

表5 L-11菌株在Biolog GN微板中的代谢活性195 mm×132 mm(96×96 dpi)

2.3.2 分子生物学鉴定

（1）16S rDNA分子鉴定。以L-11基因组DNA为模板，用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增产物约1500 bp。L-11 16S rDNA测序序列（登录号MK910214.1）进行BLAST比对,与根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens Ell-7序列（登录号FJ613554.1）相似度达到97.65%；将L-11的16S rDNA序列与其他农杆菌属的序列进行比较并构建系统发育树（图4），表明L-11与标准菌株Ell-7亲缘关系最近。因此，云南省蓝莓根癌病的病原菌鉴定为根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

图4 基于16S rDNA序列的蓝莓根癌病原菌相关种系统发育树

（2）特异性引物扩增结果（图5）。利用根癌土壤杆菌特异性引物AtP3F/AtP3R，对L-11、2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4基因组DNA进行PCR扩增。L-11扩增出155 bp的特异性片段，其他菌株均未扩增出条带，可将L-11鉴定为根癌土壤杆菌。

图5 特异性引物AtP3F/AtP3R扩增产物凝胶电泳图谱

2.4 田间药剂筛选

药剂筛选结果（表6）表明，1.5%噻霉酮水乳剂防治效果最好(52%)，1%申嗪霉素悬浮剂、C3生防菌剂、50%氯溴异氰尿酸粉剂防治效果次之，分别为48%、45%、43%。

表6 蓝莓根癌病田间药剂试验防治结果

3 结论

本研究对云南省蓝莓主产区采集的蓝莓根癌病样品进行病原菌的分离培养，通过致病性测定和多种分类鉴定方法，证实云南发生的蓝莓根癌病是由根癌土壤杆菌所致，并筛选出对蓝莓根癌病有较好防治效果的药剂1.5%噻霉酮水乳剂，为进一步开展有关该病发病规律及防治技术的系统研究提供科学依据。

4 讨论

根癌病菌可侵染93科331属643种植物，包括多种果树、林木、花卉甚至瓜类，造成严重的经济损失[15]。根癌病病原菌较多，包括土壤杆菌属、异根瘤菌属和根瘤菌属的多个种[2]。土壤杆菌属和根瘤菌属的关系一直存在争议。有学者提出按照16S rDNA序列分析可将土壤杆菌属(Agrobacterium)和异根瘤菌属(Allorhizobium)归为根瘤菌属(Rhizobium)[16]，但也有学者发现根瘤菌属(Rhizobium)中个别种与土壤杆菌属的关系不是很密切，不能笼统地说土壤杆菌和根瘤菌的关系较近，而应该深入研究土壤杆菌与根瘤菌的种间关系[17]。土壤杆菌属与根瘤菌属的鉴别标准之一是病菌引起致病症状还是引起根瘤[18]。本研究分离得到的菌株P2-2、L-3、L-11、L-5都会引起蓝莓根部肿瘤，说明这4株菌归类至土壤杆菌属。

根癌病菌通过伤口侵染植物，T-DNA在寄主植物中表达，编码生长素和细胞分裂素的生物合成，使植物细胞增殖失控，导致肿瘤的形成[19]。化学农药防治效果并不显著，持效性差[20]，1.5%噻霉酮水乳剂防治效果较好但相对防效也仅为52%。目前生物防治研究发展较快，R.rhizogenes K84（商品名根癌宁）可有效防治桃根癌病[21]。K84是Kerr于1972年发现的一株无致瘤性的发根根瘤菌[22]，主要作用方式是接合质粒pAgK84编码产生土壤杆菌素84进而杀灭细菌[23]。另外放射土壤杆菌M I-15也能有效抑制葡萄根癌菌的生长和致瘤[24]。还有无致病性的葡萄土壤杆菌E26菌株对葡萄根癌病具有良好防效[25]。目前生产上可在施用药剂的同时，采用植物检疫，苗木、砧木消毒，及时清除田间病株，选育抗病品种，改进嫁接方式等手段进行综合治理，控制蓝莓根癌病的发生，以实现蓝莓产业的可持续发展。