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丙二醛氧化对乳清蛋白结构及其抗氧化活性的影响研究

2021-07-11袁海娜武美琳林金鹏姜澳华阎钰陈唐超龚金炎赵广生肖功年

中国乳品工业 2021年6期
关键词:羰基乳清巯基

袁海娜,武美琳,林金鹏,姜澳华,阎钰,陈唐超,龚金炎,赵广生,肖功年

(浙江科技学院生物与化学工程学院浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心(2011计划),杭州310023)

0 引 言

乳清蛋白占总乳蛋白质量分数的20%,是牛乳的重要组成成分[1]。在奶酪生产中,乳清蛋白是牛乳凝结后余留的主要蛋白质。分离乳清蛋白是重要的功能食品配料[2]及膳食补充剂,可用于改善调制食品的营养价值和功能特性[3]。有研究表明,乳清蛋白氧化产物可抑制DNA的氧化损伤及低密度脂蛋白(LDL)的氧化。乳清蛋白氧化产物还可延缓脂质氧化[4]。

乳制品加工过程中产生的活性氧和活性氮易引起乳蛋白氧化。乳蛋白质的氧化会改变其理化性质及结构特性[5]。羰基、巯基和二聚酪氨酸等蛋白质氧化产物的产生与蛋白质分子二、三级结构改变相关[6-7]。进而影响蛋白质的溶解性、疏水性等[8]。同时,已有研究发现,蛋白质氧化与阿尔斯海默症等神经退行性疾病有关[9]。

丙二醛(MDA)是脂质过氧化作用产生的活性醛,其分子内羰基可与蛋白质通过共价交联,从而影响蛋白质的结构及功能[10-11]。但目前MDA对乳清蛋白结构及功能方面的研究仍不多见。因此,本文研究M DA氧化对乳清蛋白体外抗氧化活性及其空间结构的影响,以期为揭示乳清蛋白的构效关系及氧化机制提供必要的数据依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白粉(质量分数90%),贝因美婴童食品股份有限公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TCI>95%),东京仁成工业株式会社;MDA测试试剂盒、巯基测定试剂盒,南京建成生物工程研究所;2,4-二硝基苯肼(DNPH)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH>97%),国药集团化学试剂有限公司;卵磷脂(>98%)、牛血清白蛋白(BR),上海麦克林生化科技有限公司;5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸(DTNB,BR,98%),上海源叶生物科技有限公司;2,2-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS≥98.5%),合肥巴斯夫生物科技有限公司;维生素C(VC≥99%),上海长哲生物科技有限公司;蛋白上样缓冲液(Loading Buffer,5×)、电泳缓冲液(10×)、三色蛋白预染Marker,上海生工生物工程有限公司;其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 MDA的制备

采用水解1,1,3,3-四乙氧基丙烷的方法制备M DA储液[12]。将1 100 mg 1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶解于50 mL 0.1 mol/L HCl中,并在磁力搅拌下于50℃水浴中避光反应60 min,进行水解。水解结束后立即用6 mol/L的NaOH调节反应溶液pH值至7.0,即得MDA储液。为了保证M DA的氧化活性,MDA储液应现配现用。MDA浓度采用MDA浓度检测试剂盒测定。

1.2.2 MDA氧化乳清蛋白的制备[12]

准确称取乳清蛋白粉,于0.01 mol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液中充分溶解,蛋白质浓度为10 mg/m L(w/v),另加入0.5 mg/mL的NaN3以防止蛋白质腐败变质。分别采用0、0.5、5.0、50、150、300、500 mmol/L等不同浓度新鲜制备的MDA储液氧化乳清蛋白。于25±1℃恒温避光条件下,震荡氧化24 h。然后将反应液迅速进行冰浴冷却处理,并于4℃去离子水中透析72 h,以除去未参与反应的MDA。透析后样品进行冷冻干燥,得MDA氧化乳清蛋白,于-80℃冰箱中保存备用。

1.2.3 乳清蛋白氧化程度分析

1.2.3.1 乳清蛋白羰基含量测定采用DNPH比色法测定乳清蛋白羰基含量[13-14]。准确量取0.1 mL以0.01 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲液溶解的氧化乳清蛋白(氧化乳清蛋白浓度为3.0 mg/m L),置于离心管中。实验分测定组和对照组。测定组加入0.40 mL 10 mol/L DNPH(以2.0 mol/L HCl溶解),对照组加入0.40 mL 2.0 mol/L HCl,于25±1℃室温下避光反应1 h,后加入0.50 m L质量浓度20%的三氯乙酸,然后在4℃、10 000 rpm下离心10 min。弃去上清液,将沉淀中加入体积比1∶1的乙醇-乙酸乙酯混合溶液,在4℃、10 000 rpm下离心10 min洗涤沉淀3次(除去未反应的DNPH)。向沉淀中加入1.25 m L 6 mol/L盐酸胍溶液,并于37℃金属浴中恒温加热20 min溶解沉淀。然后4℃、10 000 rpm下离心10 min。取上清液,在紫外可见分光光度计370 nm下测定其吸光度。以摩尔消光系数22 L/(mmol·cm)计算每毫克蛋白质中羰基含量。蛋白质含量用考马斯亮蓝比色法测定[15]。所有实验重复3次。计算公式如下:

羰基浓度(nmol/mg)=A/C×1/(k·b)×1000(1)

式中:A为370 nm波长下吸光度值;k为摩尔消光系数;b为光径;c为蛋白质浓度(mg/mL)。

1.2.3.2 乳清蛋白总巯基和游离巯基含量测定

采用DTNB比色法测定乳清蛋白中的游离巯基[13-14]。将乳清蛋白溶解于p H 8.0的Tris-甘氨酸缓冲液中(内含0.090 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸和8 mol/L尿素)(控制蛋白质浓度为4.0 mg/mL)。取3.0 mL乳清蛋白溶液加入0.02 mL Ellman's试剂(内含4.00 mg/mL DTNB的p H 8.0Tris-甘氨酸缓冲液),充分混匀,于室温下静置30 min。以不加DTNB的蛋白质样品为对照。测定反应液于412 nm波长下的吸光度值。以摩尔消光系数13 600 L(mol·cm)计算游离巯基含量。总巯基通过试剂盒测定(南京建成生物工程)。所有实验重复3次。计算公式如下:

游离巯基含量(μmol/L/g)=A412×73.53×D/C (2)

式中:A412为反应液在412 nm波长下的吸光度值;73.53为通过106/(1.36×104)计算所得,D为稀释度(3.02);C为反应液中的蛋白质浓度(mg/mL)。

1.2.3.3 乳清蛋白二聚酪氨酸含量[9]测定

准确称取10 mg氧化乳清蛋白样品溶解于10 m L p H 6.0的磷酸盐缓冲液中,其中含有20 mmol/mL的KCl。应用荧光分光光度计(F4500,日立高新技术公司)在325 nm激发波长、410 nm发射波长、5 nm狭缝宽度下测定样品的吸光度。二聚酪氨酸含量以每毫克蛋白质的吸光度来表示。所有实验重复3次。

1.2.4 乳清蛋白体外抗氧化活性分析

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力的测定

根据Shen等人[16]的方法,于0.5 m L适宜浓度的乳清蛋白中加入等体积50μg/mL DPPH的二甲基亚砜溶液,震荡混匀,并于室温下避光反应30 min。以去离子水代替乳清蛋白为空白样品,于517 nm波长下测定各反应液吸光度值。平行实验3次。DPPH自由基清除率计算公式如下:

式中:Ai为DPPH和乳清蛋白样品反应后的溶液吸光度;Aj为二甲基亚砜溶液与乳清蛋白样品溶液混合后的吸光度;A0为去离子水代替乳清蛋白样品与DPPH混合后的吸光度。

1.2.4.2 ABTS阳离子自由基清除能力的测定

根据唐思颉等人[17]的方法,将7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾按1∶2体积比混匀,得ABTS储液备用。ABTS储液置于黑暗条件下反应16 h,使用前以无水乙醇稀释ABTS储液得ABTS工作液,至其734 nm处吸光度值为0.70±0.02,得到ABTS工作液。分别将1.0 mL浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的乳清蛋白溶液,与3.9 mL ABTS工作液混合均匀,于室温下反应6 min。以VC为阳性对照,以无水乙醇代替乳清蛋白为空白样品,于734 nm处测定各反应样品吸光度值。ABTS阳离子自由基清除率计算公式如下,平行实验3次。

式中:A1为乳清蛋白样品与ABTS反应后的吸光度值;A0为无水乙醇代替乳清蛋白与ABTS反应后的吸光度值。

1.2.4.3 抑制脂质过氧化能力[18]测定

于1.5 mL质量浓度2%卵磷脂中加入1.0 mL 4 mg/mL氧化乳清蛋白溶液,充分混匀。混合液置于30℃水浴中磁力搅拌1 h,再分别于各反应样品中加入1.0 mL质量浓度10%的三氯乙酸和1.0 mL质量浓度0.8%硫代巴比妥酸,混匀。置于沸水浴中煮沸15 min。冷却后将各反应样品于5 000 rpm离心10 min,取上清液。于532 nm处测定各样品吸光值。以去离子水为空白对照,平行实验3次。脂质过氧化抑制率计算公式如下:

式中:A1为乳清蛋白反应样品在532 nm处的吸光值;A0为空白样品于532 nm处的吸光值。

1.2.4.4 还原力的测定[19]

准确量取0.5 mL 4.0 mg/mL乳清蛋白溶液,与2.5 mL 0.2 mol/L p H 6.6磷酸盐缓冲液和2.5 mL质量浓度1%铁氰化钾溶液充分混匀。混合液于50℃水浴中保温20 min,随后加入2.5 mL质量浓度10%三氯乙酸,混匀。于3 000 rpm离心10 min,取上清液,加入2.5 mL去离子水和1.0 mL质量浓度1%FeCl3,混匀并静置10 min。以去离子水为空白对照,于700 nm波长处测定各样品吸光值,吸光值高低表征还原力大小。平行实验3次。

1.2.5 乳清蛋白SDS-PAGE分析[20-21]

将40μL适宜浓度乳清蛋白溶液与10μL 5×的Loading Buffer混匀,混合液置于100℃金属浴中保温5 min,于10 000 rpm离心5 min,取上清液。配制质量浓度5%浓缩胶与质量浓度12%分离胶,乳清蛋白上样量为10μL。采用稳压电泳,考马斯亮蓝R-250染色。以5~245 ku三色预染Marker作为参比标准,采用ZF-288全自动凝胶成像分析系统进行谱图分析。

1.2.6 乳清蛋白二级结构分析(CD)

根据Krämer A C等人的方法[22]。配制0.1 mg/mL氧化乳清蛋白溶液,采用日本分光JASCO J-815圆二色谱仪,在室温条件下,测定各乳清蛋白样品在190~250 nm范围内的远紫外CD光谱。以溶解乳清蛋白的溶剂为空白,以10 nm/min的扫描速率、0.25 s时间间隔、1.0 nm扫描宽度和0.2 nm最小间隔度,扫描5次取平均值得各样品CD光谱图。

1.2.7 乳清蛋白傅里叶红外光谱分析

根据蓝蔚青等人[23]的研究方法。准确称取1.0 mg冷冻干燥氧化乳清蛋白粉与100 mg溴化钾充分混合、研磨,并于15 MPa下抽真空压片30 s,除去背景,使用德国布鲁克V70 IR Spertrometer型傅里叶红外变换光谱仪,在4 000~400 cm-1波长范围内进行扫描。考察乳清蛋白肽链酰胺Ⅰ带(1 700~1 600 cm-1)和蛋白质特征峰变化。

2 结果与讨论

2.1 MDA浓度对乳清蛋白氧化程度的影响

蛋白质氧化过程中,蛋白质侧链上的NH-或NH2-基团极易受到MDA的攻击而生成羰基基团[10]。巯基会被氧化生成分子间或分子内二硫键,从而进一步导致蛋白质之间的交联和聚集;二聚酪氨酸形成是由于酪氨酸残基易受自由基分子攻击,和空间位置相邻的酪氨酸残基发生交联,通过两个苯环之间的碳碳单键形成二聚酪氨酸[24]。羰基、巯基及二聚酪氨酸等蛋白质氧化产物,可以表征乳清蛋白的氧化程度[25]。

2.1.1 MDA浓度对乳清蛋白羰基含量的影响

蛋白质羰基含量是目前最为广泛的表征蛋白质氧化程度的关键指标[26]。本研究分析了不同浓度的MDA氧化乳清蛋白所产生的羰基含量变化,结果如图1所示。分析图1发现:在0.5~500 mmol/L浓度范围内,MDA氧化均提高了乳清蛋白羰基含量。且在50~300 mmol/L浓度范围内,随着MDA浓度的提高,乳清蛋白羰基氧化产物含量显著升高(P<0.01)。300 mmol/L M DA使乳清蛋白羰基氧化产物较氧化前提高了3.2倍。说明MDA对乳清蛋白质的氧化作用存在显著的量-效关系。这与前人的研究结果一致[10]。然而,较氧化前,5、0.5、500 mmol/L MDA并未显著提高乳清蛋白羰基氧化产物含量(P>0.05)。有研究发现,M DA与蛋白质侧链残基结合,随着MDA浓度升高促使蛋白质解折叠[27],氧化敏感位点暴露,如赖氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸等氨基酸残基,可以通过蛋白质侧链残基直接氧化生成羰基衍生物;同时还可以通过α-酰胺化和β-分裂途径的蛋白质碳骨架断裂进行羰基化修饰[28]。如MDA分子的活性羰基可与蛋白质分子中的伯胺反应形成烯胺化合物而引入羰基。同时,MDA也会与蛋白质游离氨基反应生成席夫碱造成蛋白质羰基化[12]。但是当MDA浓度超过一定值时,蛋白质会发生聚集,空间结构变化,从而影响了MDA对蛋白质羰基化修饰反应[29]。这可能解释了500 mmol/L MDA相较于300 mmol/L MDA作用于乳清蛋白,氧化产物含量的显著差异性。

图1 MDA浓度对乳清蛋白总羰基含量的影响

2.1.2 MDA浓度对乳清蛋白总巯基和游离巯基含量的影响

蛋白质上的巯基含量通常被用来检测蛋白质的氧化程度[9]。半胱氨酸的巯基是是活性氧(ROS)攻击的重要位点,导致蛋白质发生氧化修饰[8,30]。本文研究了MDA浓度对乳清蛋白游离巯基(见图2)和总巯基(见图3)的影响。分析图2结果发现:与未氧化样品相比,较低浓度(0.5~150 mmol/L)MDA氧化乳清蛋白,显著降低了蛋白分子中游离巯基的含量(P<0.01),平均下降了27.34%。而300 mmol/L MDA氧化乳清蛋白,则显著提高了蛋白游离巯基的含量(P<0.01),这可能与MDA对乳清蛋白空间结构的影响,改变了巯基与DTNB的结合能力有关[27]。图3中显示:不同MDA浓度对乳清蛋白中总巯基含量影响显著。与未氧化样品相比较,0.5~150 mmol/L范围内MDA氧化提高了乳清蛋白中总巯基含量,考虑主要与MDA对乳清蛋白空间结构的改变有关。另外,300 mmol/L和500 mmol/L的MDA氧化乳清蛋白,使其总巯基含量较未氧化前分别下降了34.18%和26.70%,说明乳清蛋白中半胱氨酸残基的S原子被进一步氧化。综合图2和图3实验结果分析发现:MDA对乳清蛋白的氧化作用与其浓度密切相关。一方面低浓度MDA可氧化游离巯基为二硫键,而高于300 mmol/L浓度的MDA可进一步氧化半胱氨酸残基中的S原子,生成半胱氨酸次磺酸、亚磺酸和磺酸等[31],从而使得乳清蛋白中总巯基含量下降。

2.1.3 MDA浓度对乳清蛋白二聚酪氨酸含量的影响

二聚酪氨酸是蛋白质标志性氧化产物之一。不同浓度MDA氧化乳清蛋白过程中,二聚酪氨酸产物的含量变化如图4所示。分析发现:随着MDA浓度的提高,其氧化乳清蛋白中二聚酪氨酸产物含量逐渐下降。当MDA浓度高于50 mmol/L时,氧化乳清蛋白中的二聚酪氨酸含量较氧化前降低了约10.70%~94.94%,可见,二聚酪氨酸可能不是MDA作用于乳清蛋白的主要氧化产物。其原因在于MDA氧化过程中,可能并未产生自由基,无法形成两个酪氨酸残基苯环间的C-C共价交联键,从而不产生二聚酪氨酸[32]。结合图1~图3实验结果分析认为:随着MDA浓度升高,以羰基和巯基表征的乳清蛋白氧化程度加强。酪氨酸残基在蛋白质氧化过程中是否生成了3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)还需进一步分析[33]。因此,MDA对乳清蛋白氧化的主要产物还需进一步分析研究。

图3 MDA浓度对乳清蛋白总巯基含量的影响

图4 MDA浓度对乳清蛋白二聚酪氨酸含量的影响

2.2 MDA氧化对乳清蛋白体外抗氧化活性的影响

M DA氧化对乳清蛋白体外抗氧化性能,包括DPPH自由基清除率、ABTS阳离子自由基清除率、脂质过氧化能力和还原力的影响,研究结果见图5~图8。图5显示与未氧化乳清蛋白相比,MDA氧化影响了乳清蛋白的体外DPPH自由基清除活性。300 mmol/L的MDA氧化促使乳清蛋白(0.4~1.0 mg/mL)DPPH自由基清除率提高19.81%~67.71%。以VC为阳性对照,0.8 mg/mL经300 mmol/L MDA氧化乳清蛋白的DPPH自由基清除率相当于约0.03 mg/mL VC。但同时,实验中发现经150 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白DPPH自由基清除能力较氧化前下降。分析其原因可能为不同浓度MDA改变了乳清蛋白空间结构,影响了活性残基位点的空间构象,从而使其与DPPH自由基的相互作用不同[5];另外,不同浓度MDA氧化乳清蛋白的氧化产物不同,也间接影响其对DPPH自由基的清除能力[34]。

图5 MDA氧化对乳清蛋白DPPH自由基清除能力的影响

图6 结果显示,当MDA浓度在150~500 mmol/L时,乳清蛋白ABTS阳离子自由基清除率显著提高(P<0.01),其中300 mmol/L MDA清除效果最为明显,较氧化前的ABTS清除率提高68.42%~115.39%。分析原因可能是:高浓度MDA氧化乳清蛋白,致使其肽链展开,包裹在蛋白质内部的抗氧化活性位点暴露[5]。0.5~50 mmol/L MDA氧化使ABTS阳离子自由基清除能力平均降低了24.50%。其原因可能与低含量MDA致使乳清蛋白交联,不利于内部活性基团的暴露有关[10]。

图6 MDA氧化对乳清蛋白ABTS阳离子自由基清除能力的影响

图7 结果显示,当MDA浓度高于5 mmol/L时,氧化乳清蛋白的体外脂质过氧化抑制能力显著下降(P<0.01),且其抗氧化活性与MDA密切相关。5~500 mmol/L MDA氧化使乳清蛋白体外脂质抗氧化能力平均下降了12.84%~64.01%。分析其原因,一方面,可能MDA破坏了乳清蛋白的脂质过氧化活性位点,如色氨酸残基位点、半胱氨酸等[10];另外,M DA氧化改变了乳清蛋白溶解性能、疏水性能等,导致乳清蛋白抗氧化活性位点不易与脂质分子相互作用,发挥其抗氧化抑制作用[10]。其中300~500 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白体外脂质过氧化抑制活性显著高于50~150 mmol/L MDA氧化的乳清蛋白样品(P<0.01),进一步说明,乳清蛋白氧化产物及空间结构的变化对其体外脂质抗氧化活性影响显著。

图7 MDA氧化对乳清蛋白脂质过氧化能力的影响

图8 中对MDA氧化乳清蛋白还原力的研究结果发现,较高蛋白质浓度(0.24 mg/mL)条件下,经5~150 mmol/L M DA氧化的乳清蛋白的还原力均低于未氧化的乳清蛋白(P<0.01)。而300~500 mmol/L MDA氧化处理也不利于乳清蛋白还原力的发挥。这说明MDA的氧化作用改变了乳清蛋白抗氧化位点氨基酸残基的供电/供氢能力[35]。

图8 MDA氧化对乳清蛋白还原力的影响

2.3 MDA氧化对乳清蛋白分子量分布的影响

不同浓度MDA氧化对乳清蛋白分子量分布的影响见图9。实验中利用尿素对蛋白质氢键的破坏作用,研究了乳清蛋白氧化前后分子聚集情况,结果分别显示于图9A和图9B中。图9A分析显示,MAD氧化影响乳清蛋白分子的聚集程度,且与MDA浓度密切相关。当MDA浓度在0.05~300 mmol/L范围内,氧化的乳清蛋白中β-乳球蛋白二聚体和三聚体的含量随着MDA浓度的提高而增加。但与氧化前先比,当MDA浓度高于50 mmol/L时,分子量为60~75 ku的乳清蛋白多聚物含量显著降低。与β-乳球蛋白相比,α-乳白蛋白对MDA氧化作用的敏感性较弱,在本实验条件下随着MDA浓度的增加,α-乳白蛋白二聚体含量增加,但仍主要以单体形式存在。乳清蛋白中的BSA也受M DA影响,当MAD浓度高于150 mmol/L时,BSA形成了多聚物,同时单体α-乳白蛋白含量明显减少。当MDA浓度达到500 mmol/L时,β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及BSA均形成了多聚物。图9B显示,乳清蛋白样品经尿素处理前后,其蛋白质组分组成无显著差异。综合分析发现:MDA氧化改变了β-乳球蛋白、α-乳白蛋白及BSA分子的聚集状况,如MDA的两个醛基可以与蛋白质中两个不同赖氨酸残基中的氨基形成共价交联[12]。

图9 MDA氧化对乳清蛋白分子量分布的影响

2.4 MDA氧化对乳清蛋白二级结构的影响

通过远紫外CD光谱分析了MDA氧化后乳清蛋白的二级结构组成变化,结果见表1。分析发现,MDA与乳清蛋白的相互作用影响其二级结构组成。但可能是由于乳清蛋白所含的β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白等不同蛋白质分子与MDA间相互作用的差异性,使本实验中乳清蛋白二级结构组成的变化趋势与MDA浓度见未呈现明显的相关性。前人研究表明,由于β-乳球蛋白与α-乳白蛋白结构的差异性,通过热加工引起的蛋白质氧化程度不同[20]。这与本文研究结果是一致的。与氧化前相比较,150~500 mmol/L MDA对乳清蛋白二级结构的影响较显著。其中,150 mmol/L和300 mmol/L MDA处理促使乳清蛋白中的α-螺旋和β结构向无规则卷曲结构转化,这种二级结构无序性转变,利于乳清蛋白的进一步氧化[36]。

表1 MDA对乳清蛋白二级结构的影响

2.5 MDA对乳清蛋白傅里叶红外光谱的影响

傅里叶红外光谱是反应蛋白质二级结构的基本工具之一[37]。图10显示,乳清蛋白氧化前后在3 500~3 200 cm-1处均出现一个宽而强的羟基特征吸收峰,不同浓度MDA的氧化作用使乳清蛋白羟基特征吸收峰峰位较氧化前出现红移1~2波数,这可能与MDA促使乳清蛋白分子氢键作用减弱有关[10]。

图10 不同浓度MDA氧化乳清蛋白的红外光谱

蛋白质红外光谱特征峰主要包括酰胺Ⅰ带(1 700~1 600 cm-1)、酰胺Ⅱ带(1 600~1 500 cm-1)。这分别由C—N伸缩和N—H弯曲振动、羰基C=O和双键伸缩振动、C—H伸缩振动、O—H伸缩振动引起的。其中,酰胺Ⅰ带(1 700~1 600 cm-1)可以反映出蛋白质二级结构的变化。对比不同浓度MDA氧化的乳清蛋白,MDA浓度为500 mmol/L时,该特征吸收峰最强。表明通过不同MDA浓度处理的乳清蛋白二级结构的改变。

3 结 论

本研究中发现,随着MDA浓度升高,乳清蛋白氧化程度加剧,羰基含量升高,巯基含量降低,且可能生成了二聚酪氨酸外的其他酪氨酸残基氧化产物,如3,4-二羟基苯丙氨酸等,仍需进一步研究分析。MDA氧化后乳清蛋白的自由基清除能力提高,而脂质过氧化抑制活性及还原力降低,其原因还有待进一步剖析;乳清蛋白二级结构中α-螺旋和β结构向无规则卷曲结构转变,以及乳清蛋白聚集状况的变化,可能解释了MDA对乳清蛋白氧化的分子机制。本文相关研究结果为乳及乳制品加工、贮藏稳定性、乳营养等基础和应用研究,提供了有益参考。

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