崔阔澍，Aftab Ahmed，Aaqil Khan，George Bawa，方清茂，李 军，朱文涛，金 福，时健祎，彭 腾，吴茂力，肖 特,，杨文钰

（1四川省农业技术推广总站，成都 610041；2四川农业大学农学院/农业部西南作物生理生态与耕作重点实验室，成都 611130；3四川省中医药科学院，成都 610041；4成都中医药大学，成都611137；5四川省原子能研究院，成都 610066）

0 引言

多花黄精(Polygonatum cyrtonema)是中国濒危野生药用植物[1-3]，四川、贵州、湖南、湖北、河南、安徽、广西等地为主要分布区域，集药用、食用、饲用、观赏价值于一身，为中国三十大稀缺药材之一[4-5]，常用根茎繁殖，由于其根茎呈连珠状或结节成块，习称“种茎”[6-7]。优良的种茎是保障中药材生产的先决条件，因多花黄精人工驯化和栽培研究还处于起步阶段，选种用种的科学理论还不完善，导致种茎质量参差不齐，对后续药材的生产及品质产生很大影响，造成缺苗、弱苗、产量低、药用品质差等问题[8-11]。目前，已有学者进行了一些研究。李世[6]于1986年5—9月中旬研究发现种茎长度对出苗、生长及产量等均有显著影响。长度4 cm的出苗率显著降低，长度6 cm的略低，长度8～14 cm的差别不大。杨子龙、宗燕等[12-13]发现，黄精根茎繁殖，每段须具2～3节，但大田当年移栽植株越冬芽萌动迟缓，发芽率低，有的植株到第2年才发芽，并且黄精发芽时间不一致，发芽势较低。毕胜等[14]认为黄精需种茎繁殖，每段2～3节，长度8～12 cm。宫俊华、邓颖连等[15-16]研究发现不同节数黄精根茎出苗整齐度有差异，出现大量春发株地上部死亡情况。戴琴等[17]认为栽培黄精需选择健壮、颜色黄润、无病虫害、无破皮、具有顶芽的根茎作种。将先端幼嫩部分截成数段，每段2节，有1～3个芽眼。朱伍凤、Arimura、Rinne、Swartz[18-21]在收获季节选用1～2年生健壮、无病虫害植株，挖取根状茎，选先端幼嫩部分截成数段，每段2～3节，待切口稍晾干收浆后立即栽种，此法做得较好。但均只研究了多花黄精种茎节数，并未考虑多花黄精种茎规格和多年生年龄特性。本研究拟建立一种基于K-means聚类法，将多花黄精种茎规格和年龄进行等级划分，观察多花黄精植株和块茎的生长规律，摸清种茎规格和年龄对药材产量和药用品质的影响，以期为科学选种用种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

种茎无病虫害、无机械损伤，由四川省中医药科学院提供，并由方清茂鉴定为多花黄精(Polygonatum cyrtonema)。

分析天平、电子天平(CTH-553)、紫外可见分光光度计(UV-3010)、游标卡尺和直尺。

硫酸、蒽酮和乙醇为分析纯，葡萄糖对照品（纯度≥99%，批号50-99-7）购自南京森贝伽生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种茎K-means聚类法 K-means利用距离作为相似性指标，先给定一个已知数据点集合X(X1,X2,X3,...,Xn)，该集包含n个d维数据点，也给定需要的聚类数目k，k由用户指定，n个d维数据点划分到K(K≤n)集合中，k均值算法根据某个距离函数反复把数据分入k个聚类中，从而得出组内平方和最小，如式(1)[22]。

随机抽取300个多花黄精种茎准确测定单个种茎芽头数、茎长、茎径和茎质量，作为种茎规格分级指标，采用K-means聚类法进行聚类分析，将种茎分为3个规格、3个年龄（见表1～2）。

表2 多花黄精种茎年龄分类标准及各年龄段种茎占比

1.2.2 田间试验设计 试验地点为四川省资阳市雁江区祥符镇祥符村(104°29′1.29″N，30°7′56.4″E)，试验点土壤系红色沙壤土，2017年1月18日播种，2018年12月10日收获。

试验采用双因素随机区组设计，主因素为种茎规格(S)，分别为一级(S1)、二级(S2)、三级(S3)；副因素为种茎年龄(A)，分别为1年生(A1)、2年生(A2)、3年生(A3)，随机区组排列，9 个(S1A1、S1A2、S1A3、S2A1、S2A2、S2A3、S3A1、S3A2、S3A3)处理，每个处理为1个小区，小区面积81 m2(9 m×9 m)，每小区重复3次，共计27个。开沟后芽口朝上栽种，沟深度8 cm，行距30 cm，株距30 cm。每小区下种前施有机肥800 kg，后期大田管理只浇水和除草。

记录出苗时间，出苗后10天统计出苗率。以1 m2小区为单位测产，小区内采用“S”型5点取样法，测定单株和单位面积产量。地下和地上部（茎秆和块茎结合处为分隔点，以上为地上部，以下为地下部）在120℃杀青30 min后于70℃条件下烘干至恒重后，电子天平称干重。

1.2.3 药材品质检测 采用《中华人民共和国药典（2015年版）》中紫外分光光度法测多花黄精药材的多糖含量。

（1）配制对照样品溶液。取无水葡萄糖对照品33 mg（经105℃干燥至恒重），倒入100 mL量瓶中，加水定容至刻度，上下摇匀即得（无水葡萄糖浓度为0.33 mg/mL）[2]。

（2）制定标准曲线。称取6份对照品溶液，分别为0.l、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，移至10 mL具塞刻度试管中，加水至2.0 mL刻度，摇匀，立即放入0℃冰水浴中，并缓缓滴入0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度线，混匀，放冷后置水浴中保温10 min，立即取出，置0℃冰水浴中，冷却10 min。设无对照品溶液为空白。参考紫外-可见分光光度法，582 nm波长处测吸光度值。并以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标制作标准曲线[2]。

（3）测定方法。称取多花黄精药材细粉约0.25 g（60℃干燥至恒重），置于圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，然后置水浴中加热回流，1 h后趁热滤过，用80%热乙醇洗涤残渣3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流，1 h后趁热滤过，残渣和烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，然后合并滤液与洗液，冷却后转移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，参照标准曲线制备项下方法测定吸光度值，再从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的质量(mg)，后计算即得[2]。

1.2.4 数据分析 采用SPSS 20.0和Excel 2010软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 种茎规格与年龄对多花黄精出苗率的影响

从表3可以得出，多花黄精的出苗率最高达89.68%，最低为56.14%。除1年生种茎中一级和二级不存在极显著差异，其余种茎在不同规格、年龄下的出苗均存在极显著差异，表现为一级＞二级＞三级，1年生＞2年生＞3年生。由表4的相关性分析结果可知，出苗率与种茎规格、年龄间相关，相关系数分别为0.875、-0.356，说明在一定范围内，随着种茎规格等级的升高出苗率增高，而随着种茎年龄的增大出苗率降低；种茎规格与年龄间交叉互作现象存在，但互作现象不明显；各因素对出苗率贡献（偏η2）由大到小表现为种茎规格＞种茎年龄＞种茎规格×年龄。

2.2 种茎规格与年龄对多花黄精产量的影响

多花黄精单株产量和单位面积产量变化较大，其中单株产量最大为50.16 g，最小为29.75 g；单位面积产量最大为489.80 g，最小为310.74 g（表3）。在不同规格、年龄下的单株产量和单位面积均存在极显著差异，具有统计学价值，表现为一级＞二级＞三级，1年生＞2年生＞3年生。由表4的分析结果发现，种茎规格与单株产量为极显著相关，种茎年龄与单株产量达到显著相关，相关系数分别为0.910、-0.400。当种茎规格升高时，单株产量增加；当种茎年龄变大时，单株产量降低。种茎规格与单位面积产量达到极显著相关，种茎年龄与单位面积产量达到显著相关，相关系数分别为0.934、-0.410。当种茎规格升高时，单位面积产量升高；当种茎年龄变大时，单位面积产量降低。两者间的交互作用同样存在，但因互作不显著，不具有统计学价值。偏η2显示各因素对多花黄精单株产量和单位面积产量贡献由大到小表现为种茎规格＞种茎年龄＞种茎规格×年龄。

表3 种茎规格与年龄多花黄精产量和块茎多糖含量

表4 多花黄精种茎规格与年龄互作效应分析

2.3 种茎规格与年龄对多花黄精药用品质的影响

从表1可知，多花黄精药材多糖含量在各处理中均高于《药典》多糖含量不低于7%的标准。多糖含量在SlA2下达到最高(10.85%)，S2A1下达到最低(7.98%)。2年生药材多糖含量在不同规格下表现为最高，2年生＞3年生＞1年生。由相关性分析结果（表4）得出，多糖含量与种茎规格存在极显著相关，与种茎年龄存在显著相关，相关系数分别为0.605、0.397。说明在一定范围，当种茎规格、年龄逐渐升高时，多糖含量升高，相关性最高的是种茎规格。两者间的交互作用明显，具有统计学价值。各因素对多糖含量贡献（偏η2）由大到小表现为种茎规格＞种茎年龄=种茎规格×年龄。

3 讨论

3.1 K-means聚类分级法与种茎规格的应用价值分析

本研究所采用的K-means聚类法，具有运算快速、操作简便的优势，时间复杂度近于线性，对大数据集有较高效率且具有可伸缩性，广泛适用于大规模数据集[23-25]。但该法在种茎分级中也存在一定的局限性：首先，由于K-means聚类法采取均值作为等级划分界值，分界值存在客观误差。在等级划定时，一、二级的分界值一般采用一级种茎指标的均值，以二、三级的分界值采用二级种茎指标的均值。照此计算，一级种茎实际为指标大于一级均值的种茎；二级种茎实际为一、二级种茎的混合，即小于一级大于二级均值的种茎；三级种茎实为二、三级的混合种茎，即小于二级大于三级均值的种茎。其次，分级指标的设定有主观因素。在实际操作中大多数种茎无法同时满足茎长、茎径和茎重3个指标的分级要求，需要人为的选择主要指标（如种茎年龄）。基于以上因素，本研究综合比较出苗率、产量和药用品质，得出各等级种茎的优劣顺序依次为一、二、三级；一级种茎为生产用种为最佳，但成本高，且占比较低(27.3%)，因此，主要生产用种不适合；二级种茎可作为生产适宜用种，其占比较高(51.8%)；三级种茎在3个年龄下的田间出苗率虽然较低，可后期补苗，加之二、三级种茎总量占比达到72.7%，因此，作为主要生产用种较合适。此外，出苗率、单株产量和单位产量与种茎规格、年龄间存在相关性，在相同年龄下各等级种茎间的出苗率、单株产量、单位产量差异显著，说明种茎分级在多花黄精科学选种用种中具有指导意义。

3.2 种茎年龄对产量和药用品质的影响

本研究结果显示，种茎年龄变大，单株产量和单位面积产量降低。可能是种茎年龄变大导致出苗阶段生长发育缓慢，后期苗弱，植物弱苗对水分、光能和养分的利用降低[26]，从而影响产量和品质。因此，不同等级的多花黄精种茎应该存在一个年龄临界值，在该临界值内，随年龄变大单株产量和单位面积产量提高，超过临界值后，单株产量将因多花黄精对水分、光能和养分的利用降低而下降。本试验发现中在SlA2下多糖含量达到最高(10.85%)，S2A1下达到最低(7.98%)，均高于标准。在不同种茎规格下均表现为二年生多糖含量最高，一年生最低。可能是多花黄精为多年生植物，种茎繁殖一般2～3年收获，这时黄精种茎生理年龄较适宜，种茎出苗快，植株后期生长发育好，导致多糖积累多。刘跃钧等[27]研究发现，黄精1龄级根茎，在当年对黄精生长的前期有效促进了黄精地上发芽。同时，肖关丽等[28]发现，马铃薯生理年龄会直接影响田间出苗时间、整齐度、苗数和植株长势等。同时，随着种薯生理年龄的增加，马铃薯种薯的萌芽数、主茎数和单株结薯数增加，但平均薯重下降。另外，张晓伟等[29]在半夏种茎研究中也得出类似现象，半夏播种材料净增产量和增重比与生理年龄有很大关系，当种茎生理年龄增大时，增重比和增产量随之降低，2年生珠芽的总生物碱含量显著高于3年生。因此，适宜的种茎年龄能促进药材产量和药用物质的形成，有利于提高产量和药用品质。年龄太大或太小的种茎产量和品质均有降低现象。

4 结论

本研究发现种茎规格、年龄与出苗率相关，在一定范围内，随着种茎规格等级的升高出苗率增高，而随着种茎年龄的增大出苗率降低。种茎规格与单株产量、单位面积产量极显著相关，种茎年龄与单株产量、单位面积产量显著相关，当种茎规格升高时，产量增加；当种茎年龄变大时，产量降低。种茎规格与多糖含量极显著相关，种茎年龄与多糖含量显著相关，在一定范围，当种茎规格、年龄逐渐升高时，多糖含量升高，相关性最高的是种茎规格。

综上，推测种茎规格与年龄存在交互作用，高级、低龄多花黄精种茎适宜作种，能显著提高多花黄精药材产量和药用品质。