张 陈，闫红心，纪 栋，魏志豪，姚志松，CAMARA ZOUMANA，苏有勇

（昆明理工大学农业与食品学院，昆明 650500）

0 引言

根据英国石油公司2020年统计年鉴显示，2019年可再生能源消费总量只占一次能源消费量的4.9%，而其中的生物质燃料消费总量占比更微乎其微[1]。中国作为全球农作物秸秆第一生产大国，据统计2002年全国农作物秸秆为6.2亿t[2]，而2005年的产量增至8亿t[3]。同样的，人民生产消费能力的提升也带动了畜牧业的迅猛发展，仅2015年中国仅奶牛养殖就有约1200万头，随之而来的是每年产生大量的牛粪，但利用率低[4-5]。尽管近年来政府出台了很多限制秸秆焚烧政策，但是还有大量秸秆仍然以不同形式的形式燃烧，而燃烧所带来的是大量的气体污染[6-8]。农作物秸秆和牛粪是一类含丰富纤维素类的生物质能源，而纤维素是一种由β-D吡喃葡萄糖通过1-4糖苷键组成的无支链结构[9]，由木质素和半纤维素结构包裹而很难被利用[10-11]。目前的学者大多围绕着如何破环木质纤维素之间的交联结构开展相关课题，主要是围绕着物理法，化学法和生物法或者三者之间共同作用等手段达到破坏纤维素结构的目的。微波法是物理法常用的方法之一，Sapci Z[12]使用微波预处理秸秆，产气量没有明显提高。而化学法通常是添加酸碱试剂、微量元素或离子液体等手段破环纤维素结构。He等[13]添加6%的氢氧化钠预处理水稻秸秆，使产气率有所提高，而且通过处理后的样品结构来详述化学试剂对秸秆处理的影响。生物法主要是酶法进行预处理秸秆样品，Wang等[14]通过微生物产生的纤维素酶预处理秸秆样品，使沼气产率提升36.9%。这些方式各有利弊：物理法和化学法作用快，但是对设备要求高且对环境不友好，而生物法作用缓慢且成本高，但是基本不会产生对下游工艺有害的化学物质。相比较而言，通过向发酵体系中直接添加高产纤维素酶菌系能持久稳定的降解纤维素，并可能与原发酵体系中的菌群形成物质能量代谢平衡，以期获得针对纤维素原料一类物质的高产气量发酵体系。并且厌氧干发酵是一种高效、环保，且对设备要求相对较低的处理方式。本试验通过将玉米秸秆和牛粪按照一定比例混合进行厌氧干发酵，希望通过添加筛选得到的高效产纤维素酶复合菌系，从而能高效利用原料中的纤维素产沼气，缓解当前环境污染并且解决当前能源危机。

1 材料与方法

1.1 材料

牛粪收集自云南省昆明市附近养殖场，新鲜牛粪用保鲜袋封口备用；秸秆购于江苏东海某农产品生加工厂，粉碎长度在0.5 cm左右；纤维素菌株分离来源于河南牧田生物科技公司和农富康公司；接种物取自昆明理工大学农业与食品学院农业环境与能源工程研究室的活性污泥。具体原料特性见表1。试验于2020年7—12月在中科院微生物研究所进行。

表1 原料特性

1.2 培养基

筛选培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，Tryptone 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂15.0～20.0 g/L。

LB(Luria-Bertani)培 养 基 ：NaCl 10 g/L，Yeast Extract 5 g/L，Tryptone 10 g/L。固体培养基需要加琼脂15.0～20.0 g/L。

1.3 试验装置

批量发酵试验装置为本实验室自制沼气发酵装置，具体装置如图1所示。主要分为发酵装置和和集气装置组成。发酵装置是由500 mL塑料瓶组成，瓶口连接一个放气阀和一个导气管，导气管连至集气装置。储气采用排水集气法，储气瓶外侧粘有经过标定的刻度线，用作读取产气量。

图1 批量试验装置示意图

1.4 试验方案

1.4.1 产纤维素酶菌种筛选 将所购的产纤维素酶菌样按照固液比1:10加入无菌蒸馏水，放置于30℃恒温摇床200 r/min摇匀2 h制成菌悬液。将菌悬液梯度稀释涂布至CMC-Na初筛培养基，菌株长出后重新再初筛培养基上划线纯化。将单菌落按照两点法接入CMCNa培养基，利用刚果红浸染法对初筛的产酶菌株进行复筛。根据透明圈大小选择高产纤维素酶菌株构建复合菌系。对筛得的菌株进行分子生物学鉴定，利用引物27F和1492R扩增16rDNA。PCR产物送测序公司测序，再与EZbiocloud数据库(www.ezbiocloud.net)进行比对，初步鉴定菌株。

1.4.2 复合菌系构建 参考前人的试验方案[15]，首先将菌株接入LB液体培养基，选取一株菌涂满LB固体培养基，其余菌株用滤纸片浸润后按照图2的示意图贴于固体培养基表面。选择生长互不影响的菌株构建成复合菌系。

图2 拮抗试验示意图

1.4.3 发酵试验 本试验总发酵体系为200 g，总发酵固体物含量(TS)为20%，接种物含量为30%，用沼液补足质量。复合菌系中的菌株按照1:1的比例，总发酵体系1%的比例接入发酵体系。本次试验设置2个不加复合菌系的对照组和不添加发酵原料的空白组。具体物料添加表见表2。发酵温度在沼气发酵能正常产气的前提下，按照复合菌系正常的生长温度设定，故本次发酵温度设定为37±1℃。测定发酵启动前和发酵结束测定发酵体系的TS、挥发性固体(VS)和pH，过程中测定每日沼气产量，甲烷比例。由于发酵总固体物含量较高，每日两次摇匀发酵瓶。由于空白组产气极少，实际计算中未考虑其产气量。

表2 发酵物料配制

1.5 测定指标及方法

物料的TS和VS的测定参考文献[16]；pH的测定使用pHS-3C酸度计测量；产气量根据储气罐上的之前标定的刻度确定；甲烷测定使用岛津GC-14B气相色谱测定，检测条件为柱温50℃，进样口温度为80℃，检测器温度为130℃。

2 结果与分析

2.1 降解纤维素菌株筛选

初筛纯化后获得18株降解纤维素菌株，具体菌株编号见图3。根据刚果红浸染CMC-Na培养基后通过透明圈的大小确定6株具有较高纤维素降解能力的菌株，然后通过分子生物学方法对其进行鉴定，复筛的培养基图如图4所示，具体的6株菌株编号和鉴定结果见表3。

表3 菌株编号及其鉴定结果

图3 降解纤维素菌株初筛

2.2 复合菌系构建

根据筛选到的6株菌按照图2的方式进行拮抗试验，试验结果如表4所示，可以看出(ZC-1,NF-4)，(NF-3,NF-4)，(ZC-3,NF-4)，(NF-3,YJ-2)，(NF-3,YJ-5)，(NF-4,YJ-2)等菌株组合之间是没有拮抗作用的，结合图4中透明圈大小的结果，选择(NF-3,NF-4)组合作为复合菌系。

图4 降解纤维素菌株复筛

表4 菌株之间拮抗结果

2.3 复合菌系的添加对产气量的影响

每日测得的沼气量取平均值作折线图，每日的沼气量累计作折线图，如图5所示。可以看出不加复合菌系的对照组和添加复合菌系的试验组前期日产气量曲线基本类似，发酵第一天产气量达到顶峰后迅速下降。但是发酵中期对照组产气量缓慢上升，在发酵第13天达到最大值，然后缓慢下降至发酵结束。而试验组在前期达到顶峰后产气降为0 mL。试验组发酵中后期产气量一直稳定在100 mL左右。

图5 日产沼气量和累计沼气产量折线图

日产甲烷量和累计甲烷产量如图6所示。试验组和对照组前期产甲烷曲线类似，发酵中期对照组出现产甲烷高峰，最高日产甲烷量达到72.8 mL，之后逐渐回落。而试验组在发酵周期前半段甲烷产量低于对照组，待对照组进入发酵后期，试验组日产甲烷量才稳步提高，在第19天日产甲烷量达到高峰，为70.2 mL。

图6 日产甲烷量和累计甲烷产量折线图

对照组和试验组的发酵周期分别为20天和28天，总产气量分别为2.4 L和3.0 L，累计甲烷产量分别为543.7 mL和845.1 mL。添加复合菌系使产气量提高了25%，甲烷产量提高了55%。

2.4 复合菌系的添加对产气率的影响

产气率一般能体现物料作为发酵产气的好坏标准之一，而池容产气率能体现发酵池综合产气效率。计算对照组和试验组的原料产气率和平均池容产气率绘制柱状图（图7）的分析可知，试验组的原料产气率分别为86.4 mL/gTS和111.4 mL/gVS均比对照组提高了21.3%，而平均池容产气率略低于对照组，降低了14%。

图7 产气率和平均池容产气率柱状图

3 讨论

3.1 研究的优缺点及优化方向

纤维素是农作物秸秆的主要成分之一，为了对其进行资源化利用，首先就要解决其转化成可溶性糖的效率，而其被木质素和半纤维素包裹而难以分离是主要的难点之一[22-25]。木质素和半纤维素结构没有纤维素结构那样具有单一单体以单一形式的化学键连接排列的规律结构，所以使用化学法和物理法对其破坏远比生物法效率高[26-27]。赵晨等[28]详细对比各种预处理方案，总结出NaOH预处理从效果和成本考虑均是最佳，预处理7天使得原料产气率达到225 mL/gVS，产气量提高450%。而本试验在最优条件下的原料产气率也仅有111 mL/gVS，虽然高于对照组，但低于一般以餐厨废弃物或绿色植物等为发酵原料的产气率，这也可能与原料实际特性和干发酵的特点所致[17-19]。基于此次试验方式为干发酵，对空间利用率一般会高于正常的湿式发酵，由于本实验原料为难以发酵的纤维素类原料，所以综合来看，平均池容产气率基本与一般文献报道的结果类似[20-21]。从结果来看不论是以什么方式进行预处理，对厌氧发酵产沼气性能均有一定的促进作用，如果考虑成本、对环境的影响、对下游的处理成本等因素来考虑，很多预处理方式差强人意。生物法相对于化学法而言的优势体现在对环境友好，对设备要求低。对废弃物的处理若是以牺牲环境为代价便得不偿失。

生物法预处理主要是利用降解纤维素菌株产的纤维素酶预处理或者与化学法等其他手段耦联预处理原料，再进行厌氧发酵产沼气。赵肖玲[29]详细对比了酶法预处理、菌液预处理、不同酶不同比例和两种方法混合预处理对秸秆发酵产沼气的性能的影响，结果得到混合酶预处理效果优于菌液预处理，而两种方法混合预处理优于单一方法预处理的结论。这种酶法预处理仅将纤维素降解为可溶性糖，实质与可溶性糖类原料发酵无异。而本试验拟解决的主要问题是希望通过筛选出高效降解纤维素类原料的菌株构成复合菌系，利用筛选得到的复合菌系添加至发酵体系，希望能够与原发酵体系中的发酵菌群达到共生体系。利用产纤维素素酶类添加至发酵体系，不仅对原料进行降解，而且参与到厌氧发酵产沼气循环中，相当于增加了发酵三阶段中的第一阶段途径，使得物质能量之间代谢循环得以增强。与前人对比发现，未来所要解决的是如何缩短发酵周期，提升产气效率。其中一个方向是如何筛选到更适合发酵体系的复合菌系，复合菌系比单一菌株更能适应环境，更能提供多种不同的组合酶[30]。另一个方向是对接种物的驯化，利用原料驯化复合菌系使之更适应原料，从而来提高产沼气性能。朱继英等[31]和席江等[32]给出不同的观点，但都提出利用原料驯化接种物对菌群结构有影响的结论。

3.2 研究的意义

21世纪以后，众多以高科技为核心的清洁能源如核能、太阳能、海洋能等在科技的带动下如雨后春笋般发展，尤其是政府成功的结合某些贫困地区的特点而提出的光伏脱贫模式，这为太阳能产业锦上添花[33-34]。近年来沼气行业似乎成为“夕阳产业”，大中型沼气项目原料来源不稳定，中小型项目效益低下，沼气下游能源转换技术不成熟，没有政策扶持等一系列问题摆在从业者面前[35-36]。正如前文所提到的，厌氧发酵产沼气不仅能解决能源短缺，另一个重要的方向是解决废弃物处理问题，从而带动农业和畜牧业的健康循环发展。如今随着农业和畜牧业的机械化自动化的普及，在原料的获取上越来越有利，如何将这些资源有效利用，并以环境治理为特色是今后科研工作者要解决的重要难题。

4 结论

试验经过初筛得到18株能够降解纤维素的菌株，经过刚果红浸染复筛得到6株具有较高纤维素降解能力的菌株。根据拮抗试验筛选到最佳的复合菌系组合为 (Bacillus siamensis, Bacillus subtilis subsp.Stercoris)，该复合菌系能共存且二者产纤维素酶能力较强。厌氧发酵产沼气试验中，复合菌系的添加主要影响发酵中后期的产气，能够明显提高沼气产量和甲烷产量，对原料的产气率也有一定促进作用，但是延长了发酵周期，降低了平均池容产气率。