刘友花，李 健，王 丹，解福双，郭志刚

浙江清华长三角研究院，嘉兴 314000

玉米大斑病又称枯叶病，分布广泛，染病后叶枯死，导致减产，是目前玉米生产中经常遇到的主要叶斑病害之一，给中国玉米种植业造成严重损失[1]。目前主要用来防治该病的农药常为化学农药，而化学农药一方面会使菌株产生多种防御机制，产生新的耐药株，另一方面影响食品安全，危害人类健康，因此研发高效、低毒、无残留的生物农药势在必行[2-4]。博落回属(Macleaya)植物隶属罂粟科，是生于海拔150～830 m的丘陵或低山林、灌丛或草丛间的多年生草本植物，全株含有乳黄色毒酱汁，来源丰富，分布广泛，民间常用作杀蛆。中国植物志记载了博落回(M.cordata)和小果博落回(M.microcarpa)两种，有清热解毒，杀虫止痒的作用[5-7]。目前，关于博落回的研究主要集中在国内，且主要集中在博落回粗提取物或者主要成分的杀虫活性方面的研究[8-10]，鲜有对博落回中单体化合物抑制玉米大斑病的活性探讨。本文将报道这些生物碱类成分的提取分离方法、结构鉴定以及体外抗玉米大斑病的活性研究。

1 材料与方法

1.1 材料

博落回粗粉于2017年8月1日购置长沙上禾生物有限公司，由郭志刚教授鉴定，标本存放于浙江清华长三角研究院1801标本柜。

1.2 仪器和试剂

柱色谱正相硅胶(200～300目)为青岛海洋化工厂生产。

分析制备用HPLC仪器为LC-20A型液相色谱仪(日本岛津公司)；MPLC采用Dr Flash-S分离纯化系统(苏州汇通有限公司的)，色谱柱为ODS(C18，MB 100 40～75 μm，Fuji，日本)；ESI-MS 采用Agilent 1200-1600 MS,以甲醇为溶剂，直接进样测定；1H和13C NMR谱采用Bruker核磁共振仪，以TMS为内标。

1.3 实验方法

1.3.1 提取和分离

博落回茎粗粉20 kg，用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比为1∶20，得到乙醇提取液经过减压浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3～4次，经HPLC检测石油醚部位提取物和乙酸乙酯部位提取物成分类似，故合并，共得到140 g，记为M。

将M组分经正相硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯[100∶0→0∶100(V/V，下同)]逐步增加梯度洗脱，每收集2 L为一馏分，经TLC检查合并，得到组分M1～M8，经过活性跟踪的方法确定了M1、M4、M5以及M6共4个组分具有抗玉米大斑病的活性。

M1(13 g)采用1.5倍200～300目的硅胶拌样，18倍硅胶填充正相硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯(93∶7)等梯度洗脱，每份收集50 mL，收集各流份后经过TLC板检查合并，得到M1-1～M1-7共7个组份，将这7个组分进行抗玉米大斑病活性检测，得到M1-2具有微弱活性，然后将M1-2重结晶得到化合物7(15 mg)。

M4(31 g)经过MPLC分离，甲醇-水(40∶70→100∶0)梯度洗脱，流速8 mL/min，每份收集200 mL，收集各流份后经过TLC板检查合并，得到M4-1～ M4-10共10个组份，将这10个组分进行抗玉米大斑病活性筛选，得到M4-4和M4-6共2个组分具有活性。其中M4-4经过HPLC 76%(流速为 6 mL/min)的甲醇-水得到组分M4-4-1～M4-4-8共8个组分，将这些组分采用TLC板以及HPLC分析验纯以及活性追踪，得到化合物1(25 mg，tR=41 min)和2(35 mg，tR=62 min)，另外将M4-4-1进一步用70%(流速为 5 mL/min)的甲醇-水纯化得到化合物8(20 mg，tR=21 min)，经过活性追踪得到化合物8具有显著的抗玉米大斑病的活性。M4-6经过HPLC 71%(流速为 5 mL/min)的甲醇-水得到组分M4-6-1～ M4-6-8共8个组分，将这些组分采用TLC板以及HPLC分析验纯和活性追踪得到化合物3(15 mg，tR=64 min)和4(20 mg，tR=73 min)。

M5(28 g)经过MPLC分离，甲醇-水(40∶70→100∶0)梯度洗脱，流速8 mL/min，每份收集250 mL，收集各流份后经过TLC板检查合并，得到M5-1～ M5-9共9个组份，将这9个组分进行活性追踪筛选，得到M5-5组分具有抗玉米大斑病活性，然后M5-5经过HPLC 71%(流速为5 mL/min)的甲醇-水得到化合物5(10 mg，tR=54 min)和6(8 mg，tR=72 min)。

1.3.2 抗玉米大斑病活性测试

按照Xu等[11]的滤纸片琼脂糖扩散法测定化合物1～8。在含有PDA培养基的培养皿中接种10 μL玉米大斑病的分子孢子，涂布均匀，然后在同一培养皿上将灭菌纸盘(直径6 mm)置于真菌接种剂周围，每个纸盘含有31.25 μg的测试样品、阳性对照(吡唑醚菌酯)以及相当体积的丙酮，每个药量重复3次，在30 ℃黑暗条件下生长3天后，观察抑菌圈的大小。然后将具有明显抑菌圈的化合物用48孔培养板进行玉米大斑病孢子萌发研究，用于这些实验的分生孢子是从生长在PDA上的3天龄真菌培养基中收集的。收集分生孢子用1/2马铃薯葡萄糖肉汤(PDB∶水=1∶1)稀释悬浮液计数并立即用于生物测定。将供试样品溶解并用丙酮∶水=1∶1稀释得到两倍的梯度浓度，并将5 μL样品添加到含有95 μL孢子悬浮液中。从而获得9.76到312.50 μg/mL的最终浓度，在旋转摇床上以150 rpm，30 ℃下培养48 h后使用光学显微镜对萌发和未萌发的分生孢子进行计数，并计算孢子发芽率。当芽管长度为孢子直径的1.5倍时认为孢子萌发。对每种浓度进行三个重复并在每个重复中计数200多个分生孢子。以吡唑醚菌酯为阳性对照，丙酮∶水=1∶1为阴性对照。用logistic剂量-反应曲线(GraphPad Prism 5统计软件)进行非线性回归分析得到IC50值。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1黄色粉末;分子式C22H19NO5；ESI-MS：m/z378 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，s，H-1)，7.11(1H，s，H-4)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.49(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.68(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.06(2H，s，H-13)，6.03(2H，s，H-14)，4.47(1H，dd，J=10.0，4.9 Hz，H-6)，1.80(1H，m，H-1′a)，1.57(1H，dt，J=14.4，4.8 Hz，H-1′b)，3.80(2H，m，H-2′)，2.69(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.9(C-1)，147.1(C-2)，148.5(C-3)，104.6(C-4)，127.1(C-4a)，139.0(C-4b)，56.8(C-6)，125.6(C-6a)，144.3(C-7)，147.6(C-8)，107.5(C-9)，116.7(C-10)，116.9(C-10a)，123.9(C-10b)，124.3(C-11)，120.1(C-12)，131.1(C-12a)，101.4(C-13)，101.1(C-14)，43.0(N-CH3)，35.2(C-1′)，61.6(C-2′)。以上数据与文献[12]基本一致，故确定化合物1为6-(2-羟基乙基)-5，6-二氢血根碱(结构见图1)。

图1 化合物1～8的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-8

化合物2黄色粉末;分子式C23H19NO6；ESI-MS：m/z406 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.54(1H，s，H-1)，7.09(1H，s，H-4)，4.82(1H，dd，J=8.7，6.7 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.34(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.47(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.69(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.05(2H，s，H-13)，6.04(2H，s，H-14)，2.41(2H，m，H-1′)，1.57(1H，dt，J=14.4，4.8 Hz，H-1′b)，3.80(2H，m，H-2′)，2.65(3H，s，N-CH3)，3.67(3H，s，2′-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：101.6(C-1)，147.6(C-2)，147.1(C-3)，104.3(C-4)，127.6(C-4a)，139.2(C-4b)，54.7(C-6)，125.8(C-6a)，147.6(C-7)，144.5(C-8)，107.7(C-9)，116.5(C-10)，115.6(C-10a)，124.0(C-10b)，123.2(C-11)，120.0(C-12)，131.0(C-12a)，100.8(C-13)，101.0(C-14)，43.1(N-CH3)，38.8(C-1′)，171.8(C-2′)，51.5(2′-OMe)。以上数据与文献[13]基本一致，故确定化合物2为6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-5，6-二氢血根碱。

化合物3黄色粉末;分子式C23H19NO5；ESI-MS：m/z390 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.52(1H，s，H-1)，7.10(1H，s，H-4)，4.87(1H，dd，J=10.5，4.2 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-10)，7.48(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.70(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.05(2H，s，H-13)，6.03(2H，s，H-14)，2.64(1H，m，H-1′a)，2.30(1H，dd，J=15.2，4.2 Hz，H-1′b)，2.06(3H，s，H-3′)，2.65(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ：104.4(C-1)，147.6(C-2)，148.2(C-3)，100.6(C-4)，125.7(C-4a)，139.3(C-4b)，54.5(C-6)，127.5(C-6a)，144.3(C-7)，147.2(C-8)，107.6(C-9)，116.1(C-10)，124.0(C-10a)，123.5(C-10b)，116.5(C-11)，120.0(C-12)，131.0(C-12a)，101.6(C-13)，101.1(C-14)，43.1(N-CH3)，46.6(C-1′)，207.2(C-2′)，31.3(C-3′)。以上数据与文献[14]基本一致，故确定化合物3为6-丙酮基二氢血根碱。

化合物4黄色粉末;分子式C24H23NO5；ESI-MS：m/z406 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.51(1H，s，H-1)，7.10(1H，s，H-4)，5.04(1H，dd，J=11.2，3.7 Hz，H-6)，6.96(1H，d，J=8.6 Hz，H-9)，7.54(1H，d，J=8.6 Hz，H-10)，7.51(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.71(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.04(2H，s，H-13)，2.58(1H，dd，J=14.9，11.3 Hz，H-1′a)，2.26(1H，dd，J=14.9，3.7 Hz，H-1′b)，2.06(3H，s，H-3′)，2.64(3H，s，N-CH3)，3.96(3H，s，7-OCH3)，3.93(3H，s，8-OCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：104.5(C-1)，147.6(C-2)，148.2(C-3)，100.6(C-4)，128.2(C-4a)，139.3(C-4b)，54.9(C-6)，127.4(C-6a)，145.5(C-7)，152.1(C-8)，111.5(C-9)，118.8(C-10)，124.8(C-10a)，123.8(C-10b)，119.8(C-11)，123.3(C-12)，131.1(C-12a)，101.0(C-13)，61.0(7-OCH3)，55.8(8-OCH3)，42.8(N-CH3)，46.9(C-1′)，207.6(C-2′)，31.1(C-3′)。以上数据与文献[15]基本一致，故确定化合物4为6-丙酮基白屈菜红碱。

化合物5黄色粉末;分子式C20H15NO6；ESI-MS：m/z366 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.19(1H，s，H-1)，7.06(1H，s，H-4)，6.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，6.60(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，7.28(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.73(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.08(2H，s，H-13)，6.00(2H，s，H-14)，8.18(1H，s，H-CHO)，2.99(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.0(C-1)，149.5(C-2)，148.5(C-3)，101.6(C-4)，135.9(C-4a)，134.6(C-4b)，165.4(C-6)，148.2(C-6a)，137.5(C-7)，150.3(C-8)，104.4(C-9)，123.4(C-10)，121.7(C-10a)，128.7(C-10b)，127.5(C-11)，127.8(C-12)，131.4(C-12a)，101.6(C-13)，101.6(C-14)，33.0(N-CH3)。以上数据与文献[16]基本一致，故确定化合物5该化合物为isointegriamide。

化合物6黄色粉末;分子式C21H19NO6；ESI-MS：m/z382 [M+H]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ：7.19(1H，s，H-1)，7.06(1H，s，H-4)，6.50(1H，d，J=8.0 Hz，H-9)，6.59(1H，d，J=8.0 Hz，H-10)，7.31(1H，d，J=8.7 Hz，H-11)，7.72(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.08(2H，s，H-13)，8.18(1H，s，H-CHO)，3.91(3H，s，7-OCH3)，3.90(3H，s，8-OCH3)，2.99(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：99.2(C-1)，149.3(C-2)，148.1(C-3)，104.0(C-4)，135.7(C-4a)，128.7(C-4b)，164.7(C-6)，146.8(C-6a)，135.8(C-7)，152.1(C-8)，104.3(C-9)，125.1(C-10)，118.7(C-10a)，133.4(C-10b)，127.4(C-11)，127.5(C-12)，131.3(C-12a)，101.5(C-13)，61.2(7-OCH3)，55.9(8-OCH3)，33.1(N-CH3)。以上数据与文献[17]基本一致，故确定化合物6为arnottianamide.

化合物7淡黄色粉末;分子式C20H15NO4；ESI-MS：m/z334 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.07(1H，s，H-1)，7.66(1H，s，H-4)，4.18(2H，s，H-6)，6.82(1H，d，J=8.1，H-9)，7.26(1H，d，J=8.1 Hz，H-10)，7.44(1H，d，J=8.6 Hz，H-11)，7.65(1H，d，J=8.6 Hz，H-12)，6.01(2H，s，H-13)，5.99(2H，s，H-14)，2.59(3H，s，N-CH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：104.2(C-1)，147.9(C-2)，147.4(C-3)，100.6(C-4)，126.4(C-4a)，147.0(C-4b)，48.5(C-6)，113.5(C-6a)，142.4(C-7)，144.5(C-8)，107.9(C-9)，116.1(C-10)，127.1(C-10a)，124.3(C-10b)，120.2(C-11)，123.8(C-12)，130.7(C-12a)，100.9(C-13)，101.2(C-14)，41.6(N-CH3)。以上数据与文献[18]基本一致，故确定化合物7为二氢血根碱。

2.2 抗玉米大斑病活性筛选

对从博落回茎中分离得到的8个单体化合物进行抗玉米大斑病活性测试，化合物1～7在31.25 μg/纸片剂量下对玉米大斑病无活性，而化合物8能明显观察到抑菌区。然后对化合物8进行玉米大斑病孢子萌发实验，化合物8表现出比阳性对照吡唑醚菌酯(IC50=18.0 ± 0.5 μg/mL)更强的活性，其IC50值为12.0 ± 0.1 μg/mL。

3 结论

本研究采用活性追踪的方法以及正反相硅胶和HPLC等分离技术对博落回茎中的生物碱类成分进行了系统研究，共分离鉴定了8个生物碱类化合物，其中化合物1、2、5、6首次从博落回茎中分离得到。在抗玉米大斑病活性筛选测试中，化合物8表现出明显的抑菌活性，而化合物1～7在31.25 μg/纸片剂量未表现出明显的抑菌活性。然后化合物8在玉米大斑病孢子萌发实验中，表现出比阳性对照吡唑醚菌酯(IC50=18.0 ± 0.5 μg/mL)更强的活性，其IC50值为12.0 ± 0.1 μg/mL。其中化合物8(白屈菜红碱)首次报道抗玉米大斑病的活性，强于阳性对照(吡唑醚菌酯)，而吡唑醚菌酯是一种广泛用于农业上控制植物病原真菌的新型杀菌剂。其他化合物未表现明显的抗玉米大斑病活性,这与以往没有文献报道这些化合物具有抗植物病原真菌活性保持一致。白屈菜红碱具有抗植物病原菌的活性，如抗番茄灰霉病[20]、水稻绿脓杆菌[21]等植物病原菌，而抑制水稻绿脓杆菌的可能机制是使其细胞壁变薄破裂以及破坏菌丝膜孢子活性氧积累，从而导致病原真菌凋亡。

以上研究初步表明白屈菜红碱可用作防治玉米大斑病的一种潜在新型生物农药，为开发新型生物农药的原料提供了一种可能，但是还需要进一步的机理机制研究来阐明白屈菜红碱抗玉米大斑病等植物病原真菌机制的特定靶标，从而有助于新型生物农药的潜在研发及利用。