胡晓娟 许云娜 徐创文 杨铿 文国樑 曹煜成

摘要：【目的】優化解磷菌PSBHY-3的培养参数，为水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产提供技术支持。【方法】通过单因素试验筛选适合解磷菌菌株PSBHY-3生长的发酵培养基碳氮源及其含量;采用Plackett-Burman试验筛选获得对菌量影响最显著的3个因子;通过最陡爬坡试验和Box-Behnken试验确定显著因子的最佳水平，建立主要培养参数的回归方程，得出优化后显著因子的最佳值及预测菌量;通过摇瓶试验验证，检验模型方程的准确性。【结果】菌株PSBHY-3的最佳碳源、氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨—酵母膏（1∶1）。以温度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和转速（C）为因素变量，菌株PSBHY-3的菌量为响应值，拟合得到二次多元回归方程Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2。优化得到的解磷菌菌株PSBHY-3最佳发酵培养参数为：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化钠3.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH 7，培养温度35.54 ℃，转速164 r/min，接种量1%，装液量60%（V/V）。在最佳发酵培养条件下，菌量实际值为1.81×109 CFU/mL，与理论菌量（1.72×109 CFU/mL）间无显著差异（P>0.05），但显著高于优化前采用营养肉汤培养的菌量（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）。【结论】通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验等优化了菌株PSBHY-3的发酵参数，显著提高了目的菌量，回归方程预测准确，优化后的发酵参数可用于水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产。

关键词： 解磷菌;解淀粉芽孢杆菌;发酵;培养参数

中图分类号： S917.1;Q178.1                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）02-0475-08

Abstract：【Objective】The cultivation parameters of phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were optimized， in order to provide technical support for its industrial fermentation production of phosphate solubilizing bacteria preparations for aquaculture. 【Method】Based on single-factor experiment， the optimal carbon and nitrogen source and their contents for the growth of phosphate solubilizing bacteria for phosphate solubilizing bacteria PSBHY-3 were screened. Then， three significant factors affecting the amount of bacteria were determined with the Plackett-Burman experiment. The optimal level of significant factors was determined with the steepest ascent and Box-Behnken experiment， the regression equation of culture parameters was established. Then the optimal values of the significant factors after optimization and the predicted bacterial amount were obtained. Finally， the validity of the model equation was verified with the shake flask experiments.【Result】The results showed that the optimal carbon source and nitrogen source of PSBHY-3 were soluble starch and pe-ptone-yeast extract（1∶1）， respectively. The temperature（A）， applied amount of yeast extract-peptone（B）， and rotation speed （C） were selected as the factor variables， and amount of strain PSBHY-3 was selected as the response variable. The quadratic multiple regression equation was proposed as follow：Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2. The optimum fermentation parameters of strain PSBHY-3 were as follows：soluble starch 10.0 g/L， peptone 10.18 g/L， yeast extract 10.18 g/L， sodium chloride 3.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， pH 7， temperature 35.54 ℃， rotation speed 164 r/min， inoculum quantity 1%， liquid volume in flask 60%（V/V）. Under the above optimum conditions， the amount of bacteria was 1.81×109 CFU/mL， which was not significantly different with the theoretical prediction（1.72×109 CFU/mL）（P>0.05）. But it was significantly higher than that cultured by nutrient broth without optimization（1.90×108 CFU/mL）（P<0.05）. 【Conclusion】Through single-factor test， Plackett-Burman test， steepest ascent test and Box-Behnken test， the fermentation parameters of strain PSBHY-3 are optimized， which significantly increases the target bacterial amount. The prediction of regression equation is accurate. The optimized fermentation parameters can be used in the industrial fermentation of phosphorus preparation for aquaculture.

Key words： phosphate solubilizing bacteria; Bacillus amylolyticus; fermentation; cultivation parameters

Foundation item： Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD54）; Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund of South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences（2019TS06）; Modern Agriculture Industry Technology System Construction Project（CARS-48）; Guangdong Provincial Special Fund for Modern Agriculture Industry Technology Innovation Teams（2019KJ149）

0 引言

【研究意义】磷元素既是养殖池塘微藻生长的必需元素之一，也是限制池塘初级生产力的重要元素之一（胡晓娟等，2010）。在养殖水体中，大量磷肥和含磷饵料进入池塘后多沉积于底泥中，转化为难溶性磷，水体中可供浮游微藻利用的活性磷相对缺乏（胡百文等，2014），不仅易使水体呈磷限制潜在富营养化，还会导致水体营养失衡和池塘底质污染等问题（刘孝竹等，2009）。研究表明，微生物可控制和影响池塘底泥的释磷效应（Tomblom and Rydin，1998;吴鹏飞等，2008）。在种植业中常通过施用解磷菌（Phosphate solubilizing bacteria，PSB）来提高植物对磷肥的利用效率（Amanullah and Khan，2015;Bakhshandeh et al.，2015）。若能将解磷菌菌剂应用于养殖池塘中，既可促进底泥中沉积磷的转化，满足池塘微藻的生长需求，又能避免外源大量添加磷肥，还可促进池塘的物质循环，减轻环境负荷。而在水产养殖业中解磷菌菌剂产品较少见报道。【前人研究进展】胡晓娟等（2017a）研究发现对虾养殖池塘的底泥中总磷浓度高，水体中活性磷浓度较低，水体和底泥中的解磷菌数量少;其后，通过多次的分离筛选，从池塘环境得到了一株解磷菌——解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PSBHY-3，其对池塘底泥总磷具有较好的降解效果，可将其作为水产养殖用解磷菌菌剂的备选菌株（胡晓娟等，2018）。研究表明，培养条件对菌株浓度具有显著的影响（杨莺莺等，2005;夏立群等，2013）。杨莺莺等（2015）研究解磷菌YC4在不同条件下的生长状况，结果发现，菌株YC4在温度20～35 ℃、盐度5～20、pH 6.0～8.5的条件下生长良好。而发酵培养的工艺水平决定了菌剂产品的菌体浓度及品质（刘惠知等，2009;Behle and Jackson，2014）。郑双凤等（2017）优化枯草芽孢杆菌NTGB-178的发酵工艺，有效提高了发酵液中的生物量及芽孢产量，其芽孢产量较优化前提高了8.48倍。钱文静等（2018）研究表明，解淀粉芽孢杆菌JT-84的最佳发酵培养基配方为葡萄糖17.51 g/L、酵母粉9.88 g/L和CaCl2 2.11 g/L。虽然胡晓娟等（2017b）、李莎莎等（2017）优化了蜡样芽孢杆菌（B. cereus）的培养参数，显著提高了蜡样芽孢杆菌的菌量，但两株蜡样芽孢杆菌的发酵工艺和生态功能均不尽相同。【本研究切入点】当前，有关解磷菌的研究主要聚焦于新菌株的筛选及其功能评价（Li et al.，2019;Ameni et al.，2020），而鲜见优化解磷菌培养参数的相关报道。【拟解决的关键问题】以解磷菌PSBHY-3为研究对象，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验等优化菌株PSBHY-3的发酵培养参数，获得可用于发酵生产的培养条件，为水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产提供数据支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 菌株 解磷菌菌株PSBHY-3筛选自养殖池塘环境，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏（编号为CCTCC NO：M2015260）。

1. 1. 2 培养基 优化前采用营养肉汤培养基培养菌株PSBHY-3，24 h的菌量为1.90×108 CFU/mL。原发酵培养基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，氯化钠3.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH 7.2±0.2。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 单因素试验 将保存的菌株PSBHY-3用营养肉汤培养基活化。在原发酵培养基的基础上，选取不同的碳源（0.5%葡萄糖、1%葡萄糖、2%葡萄糖、0.5%可溶性淀粉、1%可溶性淀粉、2%可溶性淀粉、0.5%糖蜜、1%糖蜜、2%糖蜜、0.5%蔗糖、1%蔗糖、2%蔗糖）和氮源[0.5%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、1%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、2%蛋白胨—酵母膏（1∶1）、0.5%蛋白胨、1%蛋白胨、2%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%酵母膏、2%酵母膏]，其他成分不变。按1%的接种量将菌株PSBHY-3接种至不同培养基中，30 ℃條件下200 r/min振荡培养24 h，计数各组菌株PSBHY-3菌量。

1. 2. 2 Plackett-Burman试验 根据单因素试验的结果，选取可能影响菌株PSBHY-3生长的7个因子（可溶性淀粉、蛋白胨—酵母膏、温度、pH、转速、接种菌量、装液量）作为因素，另外再设置4个虚拟因素以减少系统误差，每个因素设置高、低值2个水平，菌量为响应值Y（表1）。共设置12组试验，试验后通过方差分析筛选得到对菌株PSBHY-3菌量影响最显著的3个因子。

1. 2. 3 最陡爬坡试验和Box-Behnken试验 选取Plackett-Burman试验得出的3个影响因子进行最陡爬坡试验，确定显著因素的最佳区域与水平，建立拟合方程。然后开展Box-Behnken试验对显著因子进行3因素3水平分析。试验共包括17个组合（中心试验5个和析因试验12个）。试验后，以菌量为响应值，对17个组合的响应值进行回归分析，建立主要发酵参数的回归方程。

1. 2. 4 验证试验 采用摇瓶试验对优化后显著因子的最佳值及预测菌量进行验证，检验模型方程准确性。

1. 3 统计分析

采用SPSS 20.0检验不同碳源及氮源对菌株PSBHY-3菌量影响的显著性，采用Design-Expert 8.0.6对Box-Behnken试验结果进行多元回归分析及回归方程的方差分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 不同碳源对菌株PSBHY-3菌量的影响 由图1可看出，在碳源筛选试验中，可溶性淀粉组的菌量最高，在1.04×109～1.62×109 CFU/mL，尤以1%可溶性淀粉组最高，显著高于其他组（P<0.05，下同）。因此，后续选择1%可溶性淀粉组作为菌株PSBHY-3发酵培养基的碳源。

2. 1. 2 不同氮源对菌株PSBHY-3菌量的影响 由图2可看出，在氮源筛选试验中，1%和2%蛋白胨—酵母膏组的菌量最高，在4.15×108～4.26×108 CFU/mL，因此，后续选择1%蛋白胨—酵母膏组作为菌株PSBHY-3发酵培养基的氮源。

2. 2 Plackett-Burman试验结果

根据Plackett-Burman试验结果（表2）及回归方程方差分析（表3）可知，7个潜在因子对菌株PSBHY-3菌量影响的排序为：温度>蛋白胨—酵母膏>转速>接种菌量>可溶性淀粉>pH>装液量。因此，在后续试验中，选择温度、蛋白胨—酵母膏和转速3个因子作为影响菌株PSBHY-3菌量的显著因素。

2. 3 最陡爬坡试验结果

菌株PSBHY-3的菌量随温度、蛋白胨—酵母膏及转速3个因素水平的升高呈先升高后降低的变化规律，在第7组试验时菌量达最大（表4），即该组试验因素水平的菌量接近最大值，因此，将第7组的因素与水平设定为Box-Benhnken试验的中心点。

2. 4 Box-Behnken试验结果

以最陡爬坡试验确定的中心点设计Box-Behnken试验（表5），并对试验结果（表6）进行回归分析，得到温度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和转速（C）与菌株PSBHY-3菌量（Y）的回归方程：

Y=17.10-0.88A+0.55B+1.27C+0.24AB+0.34AC-0.24BC-3.57A2-2.78B2-6.13C2

回归方程方差分析的结果（表7）显示，回归系数模型的P=0.0024（P<0.01），说明二次回归模型显著，模型建立有意义;方程失拟项P=0.0898（P>0.05），失擬不显著，说明试验数据与模型不相符情况不显著，该模型方程可靠性良好;相关系数R2=0.9334（R2>0.9），说明模型拟合度较好。此外，温度（A）、蛋白胨—酵母膏（B）和转速（C）3个变量的二次项对菌量影响显著。

2. 5 优化验证试验结果

通过Design-Expert 8.06得到的2.4所述回归方程，在试验因素水平范围内预测菌株PSBHY-3的最佳发酵培养条件为：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨 10.18 g/L，酵母膏 10.18 g/L，氯化钠3.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH 7，培养温度 35.54 ℃，转速164 r/min，接种量1%，装液量60%（V/V）。优化后菌株PSBHY-3的理论菌量为1.72×109 CFU/mL。经验摇瓶试培养24 h的结果显示，菌量实测值为1.81×109 CFU/mL，与理论值差异不显著（P>0.05）。表明该模型方程预测准确，可用来指导水产养殖专用解磷菌PSBHY-3的发酵生产。

3 讨论

芽孢杆菌属菌株是解磷细菌的常见菌属之一，且作为解磷菌在水域环境中广泛存在（Golterman，1996）。Jana（2007）认为芽孢杆菌对磷酸钙和磷矿粉等难溶性磷酸盐有很好的溶解作用。Sahu和Jana（2000）将解磷菌应用于养殖鱼池时所使用的解磷细菌为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和多粘芽孢杆菌（B. polymyxa）。芽孢杆菌因其可产生芽孢，既易存活与繁殖，又易于发酵生产，使其成为微生物产品的重要菌种之一（王星云等，2007）。本研究中，选用从养殖池塘中分离得到的高效解磷菌株——解淀粉芽孢杆菌PSBHY-3作为优化发酵工艺的研究对象。

碳氮源是微生物必需的基础营养物质，其为微生物的生长提供原材料和所需的能量（赵能等，2016）。宋瑛瑛等（2016）认为由于菌株存在种属特异性，不同种类的菌株生长代谢所产生酶的种类及活性有所不同，这样菌株可以选择性地吸收碳氮源。因此，筛选适合芽孢杆菌生长的最佳碳氮源可有效提高菌株的产菌量（李莎莎等，2017）。本研究选取不同添加量的葡萄糖、可溶性淀粉、糖蜜和蔗糖作为备选碳源，选取不同添加量的蛋白胨、酵母膏和蛋白胨—酵母膏作为备选氮源，进行筛选优化，结果表明，菌株PSBHY-3的优选碳氮源为1%可溶性淀粉和1%蛋白胨—酵母膏。经鉴定，菌株PSBHY-3即为解淀粉芽孢杆菌，其对可溶性淀粉良好的利用效果体现了该类菌株特性。而蛋白胨和酵母膏作为常用的氮源，不仅能促进细菌的生长，还有利于其代谢产物的生成（许翠等，2015）。

最陡爬坡试验结果表明，温度和转速也是影响菌株PSBHY-3菌量的关键因素。孙镇平等（2014）的研究表明解淀粉芽孢杆菌固体发酵的最适温度约为38 ℃;单哲等（2015）采用智能温控发酵系统发酵解淀粉芽孢杆菌，可使其保持在最适宜的生长温度范围（35±0.2）℃内。本研究得到优化后的培养温度35.54 ℃与上述研究结果基本一致。菌株PSBHY-3的发酵属于需氧型发酵，可通过改变转速来调节培养系统的通气量，如果转速过慢，通气量小，不利于细菌生长;但若转速过快，可能会引起菌体自溶，致使菌量减少（刘惠知等，2009）。根据本研究对温度、氮源和转速3个因素的参数值进行优化分析，最终得到菌株PSBHY-3的最佳培养参数为：可溶性淀粉10.0 g/L，蛋白胨10.18 g/L，酵母膏10.18 g/L，氯化钠3.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH 7，培养温度35.54 ℃，转速164 r/min，接种量1%，装液量60%（V/V）。在上述培养条件下，菌株PSBHY-3的菌量实测值为1.81×109 CFU/mL，显著高于优化前采用营养肉汤培养的菌量（1.90×108 CFU/mL）。由此说明优化后的菌株PSBHY-3发酵培养参数可显著提高目的菌量，可为水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产提供数据支持。

4 结论

通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验等优化了菌株PSBHY-3的发酵参数，显著提高了目的菌量，回归方程预测准确，优化后的发酵参数可用于水产养殖专用解磷菌的工业化发酵生产。

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（責任编辑 邓慧灵）