韦莉 李霞 黄舒婷 Chanthaphoone KEOVONGKOD 何龙飞 詹洁 王爱勤 肖冬

摘 要： BAK1是富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶，参与调控植物先天免疫反应过程中的程序性细胞死亡过程。实验室已有的花生铝胁迫转录组数据揭示AhBAK1为铝胁迫响应基因。为研究其在花生抗铝机制中的作用，该文分析了铝胁迫下AhBAK1在花生耐铝品种‘99-1507和铝敏感品种‘中花2号（‘ZH2）根尖中的转录变化，采用RT-PCR技术进行扩增AhBAK1的完整CDS序列，并对序列特征进行了分析。结果表明：AhBAK1显著响应铝处理，且在‘99-1507中有着更强的诱导表达;AhBAK1包括625个氨基酸残基， 属富亮氨酸重复区类受体激酶，具跨膜域和蛋白激酶催化结构域，不存在信号肽，预测定位于细胞质膜;我们进一步构建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组质粒，体外诱导表达出约70 kD可溶性蛋白，经凝胶亲和层析纯化，最终得到基于蛋白印迹实验（Western Blot）验证正确的重组蛋白。为进一步研究AhBAK1的生物学功能和生化功能奠定了基础。

关键词： 花生， AhBAK1， 基因克隆， 原核表达， 蛋白纯化

中图分类号： Q943

文獻标识码： A

文章编号： 1000-3142（2021）04-0573-11

Abstract： BAK1， an LRR receptor-like protein kinase， interacts with other receptor-like protein kinase and mediates the programmed cell death in plant innate immune response. Previous transcriptome analysis had revealed that AhBAK1 was responded to aluminum stress. In order to explore the role of AhBAK1 in peanuts under Al stress， the transcriptional changes of AhBAK1 between Al-tolerant cultivar ‘99-1507 and Al-sensitive cultivar ‘ZH2 under Al stress were analyzed. Furthermore， the full-length CDS of AhBAK1 was amplified by RT-PCR and analyzed. The results were as follows： AhBAK1 responded significantly to aluminum treatment， with much higher induced level in ‘99-1507. Furthermore， the full-length ORF of AhBAK1 was cloned into pMD19T vector， encoding a protein with 625 amino acids and belonging to LRR receptor-like protein kinase family. It was predicted that AhBAK1 had transmembrane and protein kinase catalytic domains， and located in plasm membrane. The recombinant plasmid of pGEX-6p-1-AhBAK1-CD was further introduced into the Rosetta （DE3） to express a 70 kD soluble protein. The purified recombinant protein was verified by Western Blot analysis. The research set a foundation for further study on biological and biochemical functions of AhBAK1.

Key words： Arachis hypogaea， AhBAK1， cloning， prokaryotic expression， protein purification

铝的化学形态依赖于pH值，在酸性土壤（pH<4.5）中，铝主要以三价阳离子形式存在，是酸性土壤中植物生长主要的限制因子之一。铝对植物毒害最先影响到根的生长，根长会受到明显抑制。在对拟南芥（Arabidopsis thaliana）根长的抑制作用中发现铝可通过细胞分裂素、生长素等信号途径参与到根的抑制作用中（Yang et al.，2017）;铝也会影响植株地上部分，多数植物类囊体和光合作用电子传递链会因铝的影响受损，使光合作用明显下降（Chen et al.， 2010）;铝还会造成ROS迸发（Huang et al.，2014），改变植物体内氧化还原状态。铝毒影响到植物的诸多方面，植物也对此做出应答，细胞程序性死亡是植物应对胁迫的防御机制，是生物体在适应环境及进行自身新陈代谢过程中正常的生理反应。在烟草（Panda et al.，2008）、拟南芥（Huo et al.，2018）、小麦（Yank et al.，2017）和花生（Arachis hypogaea）（詹洁等，2008）等植物中均发现铝胁迫会诱发PCD，引发基因水平、蛋白水平及代谢水平等的转变。

在植物应答胁迫过程中，信号的识别与传递至关重要。植物类受体蛋白激酶（receptor-like protein kinase， RLKs）在植物中普遍存在，在细胞信号转导途径过程中发挥重要作用，其中LRR型RLKs是植物中最大的类受体蛋白激酶家族，BAK1为其中研究较广泛的一员，在油菜素内酯信号途径（Russinova et al.，2004）、植物先天免疫（Wang et al.，2012）、细胞死亡（Kemmerling et al.，2007）等方面起作用。前人研究表明BAK1由胞外域（负责感知信号）、跨膜域（负责胞外信号传递至胞内）、胞内激酶域组成（负责将信号传递至下游），信号传递过程中磷酸化是BAK1激酶发挥作用的重要方式，特异位点磷酸化导致下游不同的调控作用（卫卓赟等和黎家，2017）。……