冯贤巧

（阳江市植保植检和种子土肥环保管理站 广东阳江529500）

柑橘黄龙病是全球柑橘产业中威胁最大的柑橘病害[1]。我国是柑橘主产国，但有9个柑橘主产省受到该病的危害，其中，广东省有24万hm2橘园，目前有1/3以上感染该病，年损失达上百亿元[2-3]。

柑橘黄龙病的病原物为韧皮部杆菌属细菌，柑橘植株被侵染后，植株生长缓慢，发病叶片常表现为均匀或斑驳黄化，而发病果实变小或畸形，常出现“红鼻子果”或果皮青绿等症状，果实品质大大降低。柑橘感病后在3～5年内死亡或丧失结果能力[4]。

不同的柑橘品种对黄龙病菌的感病性不同，本研究利用实时荧光定量PCR，对广东省阳春市马水镇4个柑橘品种多个部位上采集的样品进行检测，定量分析了柑橘黄龙病菌在柑橘病树中的分布情况，以期为黄龙病的检测和综合防控提供参考依据。

1 材料方法

1.1 样品采集

2019年9～12 月在马水镇采集病样。选择已感染柑橘黄龙病菌的4种柑橘品种马水橘、砂糖橘、贡柑和蜜柚进行采样。每个品种随机选择3棵独立的植株进行采样，分别收集新叶、成熟叶及果实的果皮、橘络、囊壁、中心柱等部位。

1.2 植物DNA的提取及柑橘黄龙病菌的检测

用去离子水将柑橘组织冲洗干净，称取200 mg柑橘组织。采用植物DNA提取试剂盒提取植物总DNA。提取的DNA样品取1μL用核酸定量仪测定浓度，其余样品保存于-20℃条件下。检测采用实时荧光定量PCR方法，引物与探针参照Li等[5]设计的引物HL-Bas/HLBr和探针HLBr，每个样品重复检测3次，取平均值。

1.3 柑橘黄龙病菌靶标基因标准曲线的建立

参照李智鹏等人的方法[6]，将含有柑橘黄龙病菌靶标基因的阳性质粒10倍液稀释成9个浓度梯度，使用实时荧光定量仪器进行PCR检测，每个浓度梯度做3个技术性重复，并获得标准曲线。根据标准曲线获得的线性回归方程为：

y=-3.369 lg（x）+15.738， 式中，y为Ct值，x为DNA浓度，单位为ng/mL。

2 结果与分析

2.1 柑橘黄龙病菌在不同柑橘品种不同叶片部位中的含量

4个柑橘品种分别随机选择3棵有黄龙病发病症状的病树采集样品，样品使用实时荧光定量PCR方法进行检测，这些样品中的黄龙病菌含量在234.02～12 868 503.64拷贝/每克植物组织之间，平均含量约为1 641 452.32拷贝/每克植物组织（表1）。

每个柑橘树分别收集新叶叶脉、新叶叶肉、成熟叶叶脉和成熟叶叶肉样品，4个品种收集的4类样品中的柑橘黄龙病菌靶标基因平均含量顺序为成熟叶叶脉＞成熟叶叶肉＞新叶叶脉＞新叶叶肉（表1）。

成熟叶叶脉样品和成熟叶叶肉样品中的黄龙病菌靶标基因含量均显著高于新叶叶脉样品和新叶叶肉样品，但成熟叶叶脉样品和成熟叶叶肉样品中的黄龙病菌靶标含量差异不显著，新叶叶脉样品和新叶叶肉样品中的黄龙病菌靶标基因含量差异也不显著。

表1 柑橘黄龙病菌在不同柑橘品种不同叶片部位中的靶标基因含量

2.2 不同柑橘品种果实不同部位样品中的靶标基因含量

4个柑橘品种的果实分别采集囊壁、橘络、果实中柱、果皮和种皮5个不同部位的样品，囊壁样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量约为147 735.98拷贝/每克植物组织，橘络样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量约为92 038.65拷贝/每克植物组织，果实中柱样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量约为35 599.74拷贝/每克植物组织，果皮样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量约为4 316.67拷贝/每克植物组织，种皮样品中的黄龙病菌靶标基因平均含量约为91 525.49拷贝/每克植物组织（表2）。

从4个品种收集的5类样品中的柑橘黄龙病菌靶标基因平均含量顺序为囊壁样品＞橘络样品＞种皮样品＞果实中柱样品＞果皮样品，囊壁、橘络样品中的柑橘黄龙病菌靶标基因含量与果皮样品中的靶标基因含量之间有显著差异，而其他样品间无显著差异。

3 讨论

本研究采用实时荧光定量PCR对广东省阳春市马水镇4个柑橘品种9个部位中采集的样品进行检测，结果表明，柑橘黄龙病菌广泛分布于柑橘的多个部位，但在不同的柑橘个体及不同部位样品中，黄龙病菌的分布很不均匀。

表2 不同柑橘品种果实不同部位样品中的靶标基因含量

本研究对马水镇4个柑橘品种叶片样品的分析表明，成熟叶的叶脉样品和叶肉样品中的黄龙病菌靶标基因含量均显著高于新叶的叶脉和叶肉样品，与前人的研究一致[7-9]。但是，肖翠等人的研究表明，病树成熟叶片中的黄龙病菌含量显著高于新叶叶片中的黄龙病菌含量[10]，本研究数据表明，病树成熟叶片中的黄龙病菌含量高于新叶叶片中的黄龙病菌含量，但并不显著，可能与实验的采样方法有关。

褚丽萍等人研究表明，砂糖橘果实中的柑橘黄龙病菌靶标基因平均含量顺序为橘络样品＞果皮样品＞中柱样品＞囊壁样品[11]，而本研究在马水镇4个柑橘品种果实上采集的5类样品中的柑橘黄龙病菌靶标基因平均含量顺序为囊壁样品＞橘络样品＞种皮样品＞果实中柱样品＞果皮样品，存在部分不一致之处，可能与品种及采样方法有关。