庞丁玮，王军,原阳晨,于海涛,左树峰,王进茂

(1 河北农业大学 林学院，河北 保定 071000； 2 河北雾灵山国家级自然保护区管理中心，河北 兴隆 067300； 3 河北省洪崖山国有林场管理局，河北 易县 074200)

对植物进行分类是研究植物不同类群起源、亲缘关系及其进化规律的第一步[1]。叶片作为植物最重要的器官之一，是植物进行光合及蒸腾作用的主要场所，其多样性极为丰富且易采集，可以分为叶尖、叶基、叶缘等部分，故常作为植物分类最直接的依据[2]。最传统的植物分类方法是通过形态学观察和手工测量，这种方法容易使人陷入主观判断，缺乏准确性和精度[3]。

近年来，随着计算机技术的逐渐成熟，利用图像处理与识别对叶形进行分析的方法得到了广泛应用。刘骥等使用阈值分割对叶片进行二值化处理，从二值图像上提取了 8 种描述叶片形状的特征，实现了15种植物叶片识别[4]。王丽君等在形状、纹理特征的基础上提取了叶片图像的颜色，对50种观叶植物叶片图像进行识别，识别率达到了91.41%[5]。Bylesjo M等开发了一种用于自动分析叶片图像的新工具 Lamina 软件，经处理后可有效测量叶面积、叶周长等叶片性状[6]。上述研究均是在传统方法基础上利用计算机辅助对叶片进行的识别，大多分为叶片图像获取、对图像进行预处理、阈值分割及叶片特征参数的提取几个步骤，在一定程度上可以实现对植物叶片的快速识别。但是，上述方法依然存在一些不足：一是叶形变异较难量化，仅通过数量形态性状不能直观描述叶片形态的变异[7]；二是辨别形状的能力不足，不同形态可能得出相同的距离数据，如卵圆形叶片和扇形叶片形状虽不同，但其最大长度和最大宽度数据可能会相同；三是很多距离不能作为同源性状，故其同源性较难评估[8]。

几何形态学的出现，使数据的获取及分析更为容易，也为定量分析叶形形态结构的差异提供了可能。其分析方法通过将研究对象的结构转化为笛卡尔坐标，并剔除形态差异的大小、方位及物理因素的影响，只保留形状因素，使辨别样本间个体差异更加精确[9]。由于其具有操作简便、分类效果更加直观、重复性高等优点，因此被广泛应用于形态变异的研究上。如宋佳等介绍了基于叶片标志点的Morpho J 软件对叶片形态进行分析的方法[10]；刘媛等通过对槲树和槲栎2个近缘种叶片形态进行研究，探讨并总结了几何形态测量方法在植物中的应用[11]；王长海等基于Leaf Analyser 和MorphoJ 软件的测量，以可视化的形式阐明小叶杨及欧洲黑杨叶片形态的变异[7]；Viscosi等对欧洲4个栎树近缘种进行几何形态学分析，找出了其叶形变化与环境因素的关系[12]。

研究经扫描获得“冀洪1号”黑枣及普通黑枣的叶片图像，并使用Lamina软件对叶面积、叶片周长、叶长、叶宽2个形态性状进行测定，使用 Image J软件对叶片的标志点进行标定，使用MorphoJ 软件对2品种黑枣叶形变异进行分析，通过2种方法相结合，进而为深入研究“冀洪1号”黑枣与普通黑枣的亲缘关系提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究对象为“冀洪1号”黑枣叶片与普通黑枣叶片，采集于河北省保定市唐县杨家庵村和易县豹泉林场，共计25株，对其进行编号，其中“冀洪1号”黑枣起源于当地农家品种，样本采集自当地树龄超过50 a的大树，共7株，普通黑枣为自然实生品种，共18株，个体之间至少相隔50 m。随机摘取同一无性系生长位置相同(顶端向下第3片叶)，均匀一致，无病虫害及明显缺陷的成熟叶片，20片为1组，摘取3组，共60片。叶片摘下后用密封袋进行保存，运送至河北农业大学林木遗传育种实验室用于后续形态学分析。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片图像获取 将叶片用标本夹压平，待其干燥后用CanScan5600F扫描仪进行扫描，分辨率设置为600 dpi，输出格式为图片(.jpg)格式。

1.2.2 叶片性状测定及分析 使用叶形分析软件Lamina分析叶形指标，包括叶面积、叶周长、叶长和叶宽。采用EXCEL软件对数据进行整理和初步统计，采用SPSS 19.0进行方差分析和变异系数分析。变异系数(C.V)计算公式如下：

其中SD为标准差，M为均值。

1.2.3 叶片形态变异分析

1.2.3.1 标志点的获取 叶片标志点位置及描述详见图1，表1。

图1 标志点位置Figure 1 Location of the mark point

表1 黑枣叶片标志点描述Table 1 Description of leaf marker points of Diospyros lotus L.

通过Image J[13]对扫描图像进行数字化处理，分别选取13个“冀洪1号”黑枣和普通黑枣叶片的标志点，包括沿主脉分布的3个标志点(1-3)及对称结构的10个标志点(4-13)，这些标志点将被转化为每个叶片的13对坐标(x，y)，并用文本文档的格式进行保存，用于后续的分析研究。

1.2.3.2 数据的标准化处理 利用Morpho J软件进行后续的分析[14]。首先，使用普氏叠印法(GPA)对获取的数据进行分析，由所有叶片的坐标数据组成一个三维数据矩阵，根据该矩阵，对叶片各标志点的位置、尺寸及方向等非形状因素进行平移、旋转、镜像等操作，生成对应坐标之间差异极小的平均叶形，并提取叶片形状信息进行偏差检测，挑出离群值，在排除偏离群体较大的数值之后，进行数据提取和重新分类[1]。

1.2.3.3 统计分析 对叠印后的叶片形态坐标进行Procustes分析，生成协方差矩阵，基于此进行主成分分析(PCA)，找出叶片形态变异的主要特征；在此基础上对黑枣叶片形态学差异进行统计学检验，通过判别分析(DA)来讨论两品种黑枣之间的差异，相关结果以马氏距离(Mahalanobis distance)及普氏距离(Procrustes distance)展现出来。

2 结果与分析

2.1 叶片性状方差分析

对所测样本进行方差分析，详见表2。

表2 黑枣叶形性状方差分析Table 2 Variance analysis of leaf shape traits of Diospyros lotus L.

由表2可知，“冀洪1号”黑枣在叶宽上极显著高于普通黑枣，超出普通黑枣 18.89%，在叶面积、叶周长上显著高于普通黑枣，超出普通黑枣32.46%和15.25%。在叶长上，“冀洪1号”黑枣略高于普通黑枣，但未达到显著差异。“冀洪1号”黑枣4个性状变异系数均小于普通黑枣，性状变化幅度较小。

2.2 叶形变异的主成分分析

2黑枣品种叶片形态的主要变异规律见表3。黑枣叶片第一、第二主成分散点图及网格轮廓图见图2。

表3 叶片主成分分析Table 3 Principal component analysis of leaves

图2 黑枣叶片第一主成分和第二主成分的散点图及网格轮廓图Figure 2 The scatter plots of PC1 and PC2 for leaves and outline variation of Diospyros lotus L.注：A: PC1轴的值为0.14时的叶片平均形态；B: PC1轴的值为-0.14时的叶片平均形态；C: PC2轴的值为-0.09时的叶片平均形态；D: PC2轴的值为0.14时的叶片平均形态

根据Morpho J软件对黑枣叶片标志点进行主成分分析，结果显示，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)共占总体变量的63.447%(分别为50.537%和12.910%)，而前5个主成分(PC)共占叶片形态变化的85.044%，能够说明两黑枣品种叶片形态的主要变异规律。对第一和第二主成分作散点图可知，在PCA二维分布散点图中，“冀洪1号”黑枣与普通黑枣重叠区域较多，没有形成2个明显不同类群，但两黑枣品种叶片均较分散，这表明无论是品种间还是品种内都出现了一定程度的变异。

2.3 薄板样条法分析

基于薄板样条变形的矩形网格图可将叶片的位置信息在形态空间以可视化形式展现。其中的深蓝色线条代表对应的标志点与叶片平均形态(带数字的蓝点)之间的差异，线条的长度代表对应标志点的变化幅度，浅蓝色网格的弯曲代表叶片扩张和收缩的变化趋势。在同一比例下截取“冀洪1号”黑枣与普通黑枣植物扫描叶片对比见图3。

图3 “冀洪1号”黑枣与普通黑枣植物叶片对比图Figure 3 Comparison of leaves between "Jihong No.1" and ordinary Diospyros lotus L. plants

结合图2中网格轮廓的扭曲幅度可知，在PC1轴的负方向上，“冀洪1号”黑枣叶片具有较短的叶柄及较宽的叶片，为宽卵圆形，表现为标志点1,2向上收缩，同时叶片左右最宽处端点5,4的深蓝色线条指向相反的方向，并且向相反方向延长；而处于PC1正半轴方向上的普通黑枣叶片则表现出相反的趋势，具有较窄的叶片且叶柄较长，为窄卵圆形。在PC2轴上，叶片的变异主要发生在叶片最宽处(标点4和5)在左右两侧分布时的相对位置。从PC2的负值可以看出，以叶片正部为正面，“冀洪1号”黑枣叶片的左侧最大宽度处(标点5)向上延伸，较叶片右侧最大宽度处(标点4)更靠近叶片尖部，PC2正轴方向则相反。

2.4 “冀洪1号”黑枣与普通黑枣间的判别分析

判别分析(DA)是指在确定分类的情况下，根据其特征值对个体层次的物种进行鉴定的一种方法，通常用于分析数据为2个类群时，进行两两之间的比较[16]。

叶形判别分析结果见图4。

图4 叶形判别分析结果Figure 4 Results of leaf shape discriminant analysis

根据判别函数方法分析得出的统计结果表明，2品种间马氏距离(Mahalanobis distance)为1.790，普氏距离(Procrustes distance)为0.100，在差异显著性方面，两者之间无显著性差异(P>0.05)。

DA分析通过对其结果进行基于10 000次重复的P值检验， “冀洪1号”黑枣与普通黑枣重叠的部分较多。仅有62.5%的“冀洪1号”黑枣与64.7%的普通黑枣被准确的区分开，且“冀洪1号”黑枣与普通黑枣之间的T2为48.45，并不显著(P>0.05)。

3 讨论

由于叶片表型性状易识别及获得，故其表型性状多样性研究一直作为遗传多样性研究最重要的性状之一。通过对“冀洪1号”黑枣及普通黑枣的4个叶形性状进行方差及显著性分析，结果表明：“冀洪1号”黑枣与普通黑枣的叶形性状存在较大的种间差异，“冀洪1号”黑枣的叶片较大，但其变异幅度较小。可能是因为“冀洪1号”黑枣是无性系，个体之间出现的差异是环境因素及控制不同叶片基因表达的差异反应；而普通黑枣是实生苗，还包括个体基因型的差异，所以导致“冀洪1号”黑枣的变异幅度小于普通黑枣。此传统测量方法能够结合形态性状的数值化和多变量统计，但叶片形态数据难以准确量化，仅能测量叶面积、叶周长、叶长、叶宽等数量性状，形态信息不完整且不直观，而几何形态测量学技术能排除叶片大小的影响，对叶片形态结构进行量化分析，通过计算叶片标点之间的距离，借助一系列统计方法，提供更加精细的形态变异信息，这不仅给近缘种分类提供了一个新方法，也为叶形的研究提供了新思路。

研究利用几何形态方法对黑枣的2个品种叶片形态特征进行比较及判别分析，从叶片主成分分析散点图及薄板样条分析结果可以看出，“冀洪1号”黑枣与普通黑枣形态相似，仅在叶柄及叶片最大宽度处有微小差异。可能是因为“冀洪1号”黑枣是通过普通黑枣实生群体中选择优株，无性繁殖形成的新品种，对当地气候及土壤等环境因素均存在一定适应性， 故存在一定的相似性。而根据判别分析的分类结果显示，“冀洪1号”黑枣与普通黑枣之间均有误判发生，说明对于形状相近叶片，判别分析准确率并不能达到100%[17]。通过对“冀洪1号”黑枣与普通黑枣叶片进行比较，能够找出叶片间的微小差别，并且对发现叶形变异与植物遗传进化的关系有积极作用。

目前，几何形态学分析已经在脊椎动物学、昆虫学等其他领域取得了较广泛的应用，而在植物学领域应用较少。通过几何形态学与分子生物学、生态学等相结合，研究叶片表型变异，对于种间、种内分类鉴定、遗传育种、系统进化等方面有重要作用[18-20]。如曾卫东采集了27个星果草属植物居群的植物标本，经几何形态学、分子系统学及生态学研究发现，星果草与裂叶星果草不支持成立2个独立物种[3]；Wei等利用分子与形态数据相结合的方式，研究了极易混淆的辽东栎和蒙古栎在形态性状的变异，揭示了杂交率对形态性状和分类学界限的影响[21]。

黑枣具有极高的营养价值，是农民致富的主要经济树种之一，因此，通过传统方法与几何形态测量技术相结合的方式对其进行研究，能够初步探讨黑枣种间亲缘关系和叶片形态差异，使其发挥更大的应用价值。但任何方法均存在局限性，如植物形态相近时，存在误判情况发生；进行标点时，可能存在人为误差；植物叶片易受基因型及环境因素影响等情况发生。因此，需对其进行多角度研究，才能更好揭示其遗传多样性及表型变异的规律，为其保护和利用提供科学依据。