刘若一 邹忆怀 徐立 张姝珺 郭蓉娟 赵鹏

瘙痒是困扰多种皮肤病患者的主要症状[1]，同时瘙痒性疾病患者存在着广泛的焦虑、抑郁等不良心理状态，而不良心理状态可再度恶化瘙痒，使患者心理和身体两方面承受着极大痛苦。国内外多个独立的流行病学研究也证实了瘙痒性疾病与焦虑、抑郁、精神紧张等不良心理状态的关联性。2020年发表的一项在欧洲13个国家进行的横断面研究表明，瘙痒在很大程度上增加了皮肤病患者的心理负担[2]。无论是急性压力还是慢性压力，都会显著影响健康人以及那些被诊断患有皮肤病和全身疾病的人的瘙痒症状，从而导致一种恶性循环，即压力加剧瘙痒，反之亦然[3]。在治疗上，心理治疗对于缓解瘙痒也有着很大帮助，Pavlis J等[4]在分析了现有治疗特应性皮炎的瘙痒的方法后发现患者教育、睡眠管理和缓解压力是提高疗效的重要手段。目前中医学界也已注意到情绪心理与皮肤瘙痒的密切关系，从肝论治皮肤瘙痒有着良好的临床疗效，取得了临床共识。但是，其作用机制依然是国内外研究的空白。本研究从中医情志致病观点出发，聚焦于心理因素对瘙痒的恶化作用，选择丹栀逍遥散这一从肝论治代表方，采用前期研究中建立的可以有效排除心理以外因素干扰的单纯健康动物模型，探索丹栀逍遥散治疗心理因素恶化的皮肤瘙痒的疗效及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与药物

健康雄性Balb/c小鼠，8周龄，饲养于恒温(23～25℃)，光照12小时，黑暗12小时，食物和水自由供应。为了避免激素水平的日间变化对实验结果的影响，所有实验均在上午9点至12点间进行。

丹栀逍遥散方由牡丹皮3 g、栀子3 g、柴胡6 g、当归6 g、白芍6 g、茯苓6 g、白术6 g、甘草3 g组成。上述药物按成年人体质量(70 kg)剂量的2倍水煎浓缩至含生药量0.38 g/mL。

1.2 试剂与仪器

小鼠组胺(HIS)酶联免疫试剂盒，96T，上海酶联；N-甲基-对甲氧基苯乙胺与甲醛的缩合产物compound 48/80， Sigma公司，甲苯胺蓝；标准规格酶标仪，Multiskan MK3，Thermo Scientific；自动洗板机，DEM-3型，北京拓普分析仪器有限公司；电热恒温培养箱，SKP-02.600型，黄石市恒丰医疗器械有限公司；8 mm摄像机CCD-TRV86型，索尼公司。

1.3 造模与分组

采用课题组于2013年创建的“慢性心理压力恶化搔抓行为”动物模型[5]。对健康小鼠实施慢性避水应激(water avoidance stress，WAS)：在直径为55 cm的圆形水槽中央，放置一个直径7 cm的站台，将水槽注满常温水，水面高度低于平台1 cm。每日上午将小鼠置于站台上1小时，连续10天。

将实验动物随机分为3组：空白组、心理压力组、心理压力+丹栀逍遥散组。心理压力+丹栀逍遥散组每天1小时WAS，每天1次，按0.04 mL/g体质量中药灌胃，连续10天；心理压力组每天1小时WAS，每天1次等体积生理盐水灌胃，连续10天；空白组每天1小时单独隔离，每天1次等体积生理盐水灌胃，连续10天。

1.4 搔抓行为学实验

每组各取7只小鼠，最后一天WAS结束24小时后，将10 μg的compound 48/80溶于50 μL生理盐水中，皮下注射到小鼠颈背部。注射后立即将每只小鼠放回单独的笼子中，然后在安静的条件下使用8 mm摄像机记录搔抓行为120分钟。一般来说，小鼠会在注射部位表现出几处抓痕，持续约1秒，这种抓伤行为被算作一次搔抓。以每10分钟为一轮，记录每轮的搔抓次数。在分析实验数据时，观察者看不到任何关于分组及干预的信息。

1.5 皮肤肥大细胞数量检测

每组各取7只小鼠于末次应激结束后24小时，取颈背部皮肤组织标本，每只小鼠各取3块颈背部皮肤组织做组织切片，采用甲苯胺蓝染色计算每个低倍视野(×100)皮肤肥大细胞的数量，各小鼠肥大细胞数量统计结果为3次计数的平均值。所有的肥大细胞计数都是由两个不同的研究人员在不考虑实验条件的情况下进行的。

1.6 血浆组胺水平测定

取空白组、心理压力组各5只小鼠，心理压力+丹栀逍遥散组8只小鼠测量血浆组胺水平，于皮下注射compound 48/80前、注射后15分钟、30分钟和120分钟时，用颈椎脱位处死8只小鼠，用心脏穿刺法获取全血，然后收集在含乙二胺四乙酸采血管中。离心后的血浆保存在-80℃中，用于组胺的测定。使用酶联免疫吸附试剂盒测量血浆组胺水平。分析丹栀逍遥散对该小鼠模型血中组胺分泌的时相、高峰、浓度的影响。

1.7 抑郁行为学研究

取空白组、心理压力组、心理压力+丹栀逍遥散组各8只小鼠进行实验。采用空场实验、强迫游泳实验来检测小鼠的抑郁程度以及分析丹栀逍遥散对抑郁行为学的改善效应。

1.7.1 空场实验 将小鼠放入空场活动测试箱的4个圆桶(桶内中央半径为7.5 cm的区域划分为中央区)中，选择空场实验计算机图像实时检测分析系统中的抗抑郁模式。计算机自动记录运动总路程、运动时间、平均速度、中央区的路程比率和时间比率等6个指标。同时人工记录小鼠刚放进测试箱中5分钟内的直立(动物双前肢同时离地，或者双前肢放在桶壁上算作直立一次)次数。

1.7.2 强迫游泳实验 将动物单独地放在柱状塑料桶中(水深15 cm，直径20 cm)，水温(25±1)℃。强迫游泳6分钟，用秒表记录后4分钟内小鼠的累积不动(小鼠停止挣扎或呈漂浮状态，四肢有轻微动作以保持头部在水面)时间。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 搔抓行为学试验

对三组间搔抓次数进行双因素方差分析后发现：三组间均存在统计学差异，心理压力+丹栀逍遥散组搔抓次数较心理压力组明显下降，然而较空白组增多，对各时段数据的单因素方差分析表明在0～10分钟、10～20分钟、100～110分钟，心理压力+丹栀逍遥散组与心理压力组间存在显著差异，表明服用丹栀逍遥散显著降低了慢性心理压力模型小鼠的搔抓次数，尤其在观察的早期阶段效果明显。结果如图1。

图1 丹栀逍遥散对compound 48/80诱导的搔抓行为的影响

2.2 皮肤肥大细胞数量检测

心理压力组与空白组皮肤肥大细胞数量存在统计学差异(P<0.05)，心理压力组数量高于空白组；心理压力+丹栀逍遥散组皮肤肥大细胞数量与其余两组比较均无统计学差异。结果如表1所示。

表1 各组小鼠皮肤肥大细胞数量比较

2.3 血浆组胺水平测定

心理压力组与空白组、心理压力组与心理压力+丹栀逍遥散组间血浆组胺水平比较有统计学差异(P<0.05)，空白组与心理压力+丹栀逍遥散组血浆组胺水平均低于心理压力组，心理压力组+丹栀逍遥散与空白组间比较无统计学差异。在15分、30分、120分时，心理压力+丹栀逍遥散组血浆组胺水平显著低于心理压力组，故丹栀逍遥散可显著降低慢性心理压力模型小鼠的血浆组胺水平。结果如表2所示。各组小鼠血浆组胺水平随时间变化趋势如图2所示。

表2 各组小鼠各时间点血浆组胺水平的比较

图2 丹栀逍遥散对血浆组胺水平的影响

2.4 空场实验

三组间直立次数均存在统计学差异(P<0.05)，心理压力+丹栀逍遥散组小鼠在空场实验中直立次数多于心理压力组，少于空白组。结果如表3所示。

表3 各组小鼠直立次数的比较

2.5 强迫游泳实验

三组间不动时间均存在统计学差异(P<0.05)，心理压力+丹栀逍遥散组小鼠在强迫游泳实验中不动时间多于空白组，少于心理压力组。结果如表4所示。

表4 各组小鼠不动时间的比较

3 讨论

剧烈、长期、反复瘙痒的不愉快体验及局部皮损的恶化，给患者带来巨大的心理压力，而心理压力亦可直接恶化瘙痒症状及局部皮损；搔抓可以短暂解除瘙痒引起的不愉快的体验，得到欣快感，久而久之，搔抓还泛化为患者缓解其他心理压力的应对方式。故心理压力参与了瘙痒搔抓恶性循环的每一个环节，皮肤瘙痒是和心理压力密切相关的心身疾病,长期以来给患者心理和身体两方面带来极大痛苦[6]。故从畅达情志，减轻心理压力入手，可有效打断此瘙痒搔抓心理压力恶性循环，对瘙痒性疾病产生良好的治疗作用[7-8]。

中医学认为肝藏血，主疏泄，性喜条达而恶抑郁。若情志不遂，则肝气郁结，郁久化热，则血分受扰。肝主木，脾主土，木郁乘土，致脾虚湿邪不化，肝热脾湿侵渍肌肤造成皮肤瘙痒、湿疹、皮炎等皮肤疾患[9]，治宜疏肝清热健脾化湿[10]。丹栀逍遥散载于薛新甫的《内科摘要》，具有疏肝解郁，健脾和营，兼清郁热之功效，一直被历代医家遵循为治疗肝郁化火证之经典验方。在现代中医学研究中，丹栀逍遥散治疗神经性皮炎、慢性湿疹及老年性皮肤瘙痒等病疗效显著。现代研究表明，丹栀逍遥散中柴胡、当归、丹皮、栀子均具有抗炎、镇静、镇痛等作用，可调节皮肤新陈代谢，解热除烦凉血，引热下行，对红斑、瘙痒等皮肤炎症性病变有较好的疗效。尤其对伴有精神紧张，并以虚证为主的患者，特别是特应性皮炎以外的面部红斑、湿疹性病变疗效尤佳[11]。

本研究选取健康小鼠造模，可有效排除心理压力以外因素对瘙痒症状的影响。结果显示，治疗后心理压力+丹栀逍遥散组的搔抓次数显著少于心理压力组，说明丹栀逍遥散可有效改善心理压力影响下的皮肤瘙痒症。

众所周知，组胺作为最常见的致痒介质存在于人的嗜碱粒细胞和肥大细胞中。肥大细胞受到角质形成细胞分泌的如细胞因子、胺类、神经肽、神经生长因子等内源性致敏物质后释放组胺引起皮肤瘙痒，同时，肥大细胞也能刺激皮肤C-神经纤维感受器致敏导致皮肤瘙痒。组胺与质膜中的特异性受体(如H1R和H4R)结合，激活TRPV1，活化感觉神经元内的下游靶分子，包括G蛋白、磷脂酶C、磷脂酶A2、12-脂氧合酶，进而导致瘙痒[12]。本研究结果显示，心理压力+丹栀逍遥散组小鼠血浆组胺水平显著低于心理压力组，表明丹栀逍遥散可降低该模型小鼠的血浆组胺水平。前期研究以及本次研究都表明皮肤肥大细胞的数量或性质可能会因长期暴露于应激刺激而改变，但是心理压力+丹栀逍遥散组小鼠皮肤肥大细胞数量较其余两组并无统计学差异，说明丹栀逍遥散并不能降低皮肤肥大细胞数量，然而丹栀逍遥散干预后血浆组胺水平显著降低，表明丹栀逍遥散可能的作用机制为降低了肥大细胞分泌组胺的量，故可通过进一步的研究探寻丹栀逍遥散对肥大细胞及组胺分泌的更具体的作用。

且经丹栀逍遥散治疗后，该模型小鼠抑郁程度较心理压力组显著减轻，表明丹栀逍遥散对改善心理压力带来的抑郁状态作用显著。这提示了针对情绪心理的治疗也是缓解心理压力恶化的瘙痒的可能思路。现代药理研究显示，丹栀逍遥散的成分提取物具有抗抑郁、抗焦虑的作用，可以有效地改善心理应激变化[13]。研究表明，丹栀逍遥散抗抑郁作用机制可能与调节下丘脑—垂体—肾上腺(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)轴相关，可抑制HPA轴的异常亢奋[14]。心理压力可能导致HPA轴的改变，然改变情况可能与压力类型等多种情况相关，作者此前的研究证实慢性心理压力会导致HPA轴的损伤，血浆中皮质酮分泌高峰延迟。故丹栀逍遥散改善慢性心理压力恶化的瘙痒的作用机制可能与HPA轴的调节相关，但具体的作用机制有待进一步探究。

本研究发现经治疗后心理压力+丹栀逍遥散组小鼠搔抓次数仍高于空白组，说明丹栀逍遥散仅对慢性心理压力恶化的瘙痒有缓解作用，并不能完全治愈，这提示了丹栀逍遥散并不能对慢性心理压力恶化的瘙痒的机制起阻断作用。现有研究已证实了瘙痒与心理压力恶性循环的存在，瘙痒的发生与恶化主要与神经传导通路及致痒介质相关，精神源性瘙痒亦是瘙痒发生的原因之一。作者前期研究证实心理压力恶化的瘙痒可与皮肤组织中肥大细胞增多、血浆组胺水平上升及HPA轴的改变相关。近年来关于心理压力与瘙痒的研究在神经科学领域已取得显著进展[15]。苏鑫裕等[16]利用光遗传学证实中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area，VTA)两类神经元分别在不同角度对瘙痒的感觉进行调控,即GABA能神经元调控了瘙痒所带来的厌恶情绪,而多巴胺能神经元则调控了搔抓之后带来的愉悦感，提示了瘙痒与心理压力相关的脑科学相关机制。目前，降低焦虑的药物和非药物疗法显示了良好的止痒效果。着眼于情志，从肝论治皮肤瘙痒已是治疗皮肤瘙痒的公认疗法[17]。本文已证实丹栀逍遥散可通过控制组胺释放，改善抑郁等机制来缓解慢性心理压力恶化的皮肤瘙痒，而在神经传导通路、非组胺致痒介质方面的相关机制上仍需进一步研究。

基于以上实验结果，认为丹栀逍遥散可缓解慢性心理压力影响下的小鼠的瘙痒症状，其可能的机制是控制了组胺的释放及改善小鼠的抑郁状态。