王红芳 余细球 叶静 范昭

微小核糖核酸(miRNA)是一类高度保守的非编码小分子核糖核酸(RNA),可以特异性结合靶细胞mRNA,调控靶基因的蛋白表达,参与肿瘤的发生发展［1,2］。其中miR-34 在很多肿瘤细胞系中表达缺失,从而导致细胞增殖、抗凋亡和转移相关基因的表达增加,具有抑癌基因作用,如B 细胞淋巴瘤-2(bcl-2)、白细胞分化抗原44(cd44)、Noch1 等［3］。survivin 作为凋亡抑制蛋白,是miR-34a 的靶基因之一,在细胞增殖和凋亡平衡中发挥重要调控作用。本研究通过荧光定量PCR 技术,检测miR-34 和survivin 基因在人结肠癌组织和癌旁组织中的表达情况,探讨二者与结肠癌发生、发展的关系及作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 临床资料和标本取自2015 年1 月～2017 年12 月深圳市罗湖区人民医院和深圳市北大深圳医院32 例患者手术切除的新鲜组织,其中32 份结肠癌组织(腺癌)标本作为癌症组,32 份癌旁组织标本(据切缘＞2 cm)作为癌旁组,均经病理组织学证实,且在-80℃条件下速冻保存。其中男20 例,女12 例；年龄41～73 岁,平均年龄(59.2±6.1)岁。所有标本收集均得到医院伦理委员会批准,获得患者知情同意并签字。

1.2方法

1.2.1总RNA 提取和miRNA 反转录 50 mg 组织剪碎后,按照Trizol(Invitrogen) 说明书提取总RNA,用分光光度仪检测提取总RNA 含量和纯度,抽提的RNA A260/A280为1.7～2.0。取 总RNA 1 μg,用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR 试剂盒(TaKaRa)进行反转录：2×miRNA Reaction Buffer Mix 5 μl,0.1%BSA 1 μl,miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl,用水补至10 μl,反应条件：37℃ 60 min,85℃ 5 s。反应结束后,用不含RNA 酶的水稀释体系至50 μl,取1 μl 进一步做荧光定量 PCR。

1.2.2荧光定量PCR 分析引物均由上海生物工程有限公司合成,miR-34a 引物序列：tggcagtgtcttagctggttg ；miR-34b/c 引物序列：caatcactaactccactgccat；survivin 引物上游序列：cacctgaaagcttcctcgac,下游序列：tctaacctgccattggaacc；U6 引物上游序列：ctcgcttcggcagcaca,下游序列：aacgcttcacg aatttgcgt。

反应体系：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μl,上下游引物各1 μl(10 μM),cDNA 1 μl,用水补至20 μl 体系。……