李盛楠 李 钒 管修晨 白玉兴

(首都医科大学附属北京口腔医院正畸科 口腔医学研究所，北京 100050)

甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)是在研究恶性肿瘤引起高钙血症机制的过程中分离出的一种多肽类物质，因其氨基酸末端与甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)相似而得名，两者具有共同受体甲状旁腺激素I型受体(parathyroid hormone type I receptor, PTH1R)，并认为PTHrP是PTH调节骨形成和骨重建过程中针对局部区域起效的关键作用物[1]。

PTHrP主要以自分泌、内分泌或旁分泌方式调节细胞增生和分化，在骨骼发育、软骨生成、成骨及破骨等生理过程中起着重要的作用[2]。研究[3-4]显示PTHrP可以促进成骨细胞或未成熟的成骨细胞增生、分化，有效地增加骨质疏松患者的骨密度，加快骨折的愈合，甚至在促进骨形成效能方面已经超越PTH。与甲状旁腺激素相类似，PTHrP对骨组织的代谢也具有双向调节作用[5]。研究[6]显示，持续性PTHrP刺激能够通过激活Notch信号通路促进牙周膜细胞的破牙骨质向表达 ，或通过核因子κb受体活化剂配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL) /降低骨保护素(osteoprotegerin，OPG)信号通路抑制成牙骨质细胞的矿化及成牙骨质向功能活性[7]。但以往研究[5-7]都关注于PTHrP的分解代谢作用，而间断性PTHrP对牙周组织影响的研究尚未见报道。

牙骨质是覆盖于牙根表面的一层矿化组织，成牙骨质细胞贴在牙骨质表面，是牙骨质的功能细胞，促进基质沉积，刺激新牙骨质生成，在牙齿移动过程中发挥重要作用，同时直接参与牙根吸收后的修复。本研究拟通过体外培养成牙骨质细胞OCCM-30，利用甲状旁腺激素相关蛋白PTHrP(1-36)及PTH1R阻断剂PTHrP(7-34)，探索间断性PTHrP在调节牙骨质生成过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞

OC-Tag转基因小鼠磨牙牙周组织细胞分离纯化的永生化成牙骨质细胞株OCCM-30细胞，来自于美国国家卫生研究院的Somerman教授赠送。将细胞生长于含10% (体积分数)胎牛血清和双抗[1%(体积分数)青霉素100 U/mL、链霉素 100 μg/mL]的DMEM中，于37 ℃、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：恒温培养箱 (德国贺利氏公司)、Real-Time分析仪(美国Applied Biosystems公司)、紫外可见分光光度计(美国NanoDrop公司)。

试剂：Annexin: FITC 凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；BCA蛋白定量分析试剂盒(中国碧云天公司)；real-time PCR引物(日本Takara公司)；COL-1抗体 (美国Abcam公司)；OPN抗体、IGF-1抗体 (美国Santa Cruz Biotechnology公司)。

主要试剂配制：将PTHrP(1-36) 或PTHrP(7-34)粉剂(美国Bachem公司)以1 mg/mL溶于乙酸中保存于-70 ℃，使用时加入含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基中，使得PTHrP(1-36)、PTHrP(7-34)终浓度为2.5 nmol/L ，配制含相同体积比例乙酸的DMEM培养基作为对照组。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞分组与处理

当细胞生长密度达到80%～90%时，对细胞进行分组处理：对照组、PTHrP(1-36)组或 PTH1R阻断剂组。间歇性给药模式包含3个周期，48 h/周期，每个周期前6 h使用含PTHrP(1-36) 或PTH1R阻断剂PTHrP(7-34)的培养基，余下42 h换为普通培养基。3个周期结束后，消化、收集细胞并进行后续检测。

1.3.2 流式细胞术检测PTHrP对成牙骨质细胞OCCM-30细胞凋亡的影响

对成牙骨质细胞给予PTHrP(1-36)、PTH1R阻断剂PTHrP(7-34)刺激3个周期后，PBS清洗3次，收集细胞。预冷PBS洗涤细胞2次后，加入500 μL 结合缓冲液重悬细胞，再加入5 μL 荧光标记的Annexin V，混匀后，加入5 μL 碘化丙啶，混匀后避光室温下孵育5 min，再加入500 μL结合缓冲液，转至流式检测管，立即上流式细胞仪分析。通过相应的配套软件，计算分析各样本凋亡细胞的百分比。

1.3.3 茜素红染色观察PTHrP对成牙骨质细胞矿化功能的影响

在对照组、PTHrP(1-36)组和PTHrP(7-34)组培养基中分别添加矿化诱导液(50 μmol 抗坏血酸磷酸盐和10 mmol/L β-甘油磷酸钠)进行诱导，成牙骨质细胞继续培养10 d后,经95%(体积分数)乙醇固定细胞10 min，双蒸水洗3次后，0.1%(体积分数)茜素红溶液(pH值为8.3)染色30 min，干燥，镜下观察矿化结节的形成情况。

1.3.4 Real-time PCR检测

收集细胞后进行RNA提取以及反转录，real-time PCR反应体系包含10 μL SYBR混合物，7.2 μL 灭菌蒸馏水，2 μL cDNA和0.8 μL 引物。进行3次独立实验。PCR引物详见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.5 Western blotting法检测

细胞经过3个周期处理后，使用预冷的PBS洗涤细胞。加入细胞裂解液对细胞进行裂解。在4 ℃，14 000 r/min离心20 min，取少量上清至新的EP管中，用于BCA蛋白定量检测。将等量的蛋白质加入到10%(质量分数)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离，转至PVDF膜上。用5%(质量分数)脱脂奶粉室温封闭1 h后，将待测抗体和内参按照一定比例用封闭液封闭，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后，加入羊抗兔、羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h。二抗孵育结束后，用TBST洗涤3次。将配好的等体积增强化学发光(enhanced chemiluminescent, ECL)的两种液体混合后，显色，于暗室中进行曝光。应用Image-Pro Plus软件分析灰度值，进行3次独立实验。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 间歇性PTHrP刺激对成牙骨质细胞OCCM-30凋亡的影响

给药前，对照组、PTHrP组、PTH1R阻断组凋亡细胞百分比分别为12.6%±1.0%、13.4%±0.6%和12.4%±0.9%，各组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在间断性PTHrP(1-36)刺激3个周期后，流式结果显示PTHrP组早期和晚期凋亡细胞比例明显下降，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。相反，在PTH1R阻断剂PTHrP(7-34)刺激下，成牙骨质细胞早期和晚期凋亡的百分比明显增加，明显大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 间断性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3个周期后成牙骨质细胞OCCM-30凋亡细胞百分比

2.2 间歇性PTHrP刺激对成牙骨质细胞OCCM-30矿化功能的影响

成骨诱导液诱导OCCM-30细胞的同时分别加入PTHrP(1-36)、PTH1R阻断剂，间歇性刺激后茜素红染色结果显示PTHrP组矿化结节形成增多，更加明显，茜素红染色更深。相较于对照组，PTH1R阻断剂PTHrP(7-34)刺激下矿化结节形成数目更少，茜素红着色更浅(图2)。

图2 间断性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3个周期后成牙骨质细胞OCCM-30茜素红染色

2.3 间歇性PTHrP刺激对成牙骨质相关蛋白OPN、COL-1和IGF-1的mRNA表达的影响

与对照组相比，间歇性PTHrP(1-36)给药刺激后，成牙骨质相关蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表达均明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。相反，PTH1R阻断剂组中成牙骨质相关蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表达明显下调，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 间断性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3个周期后成牙骨质细胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1 mRNA表达变化

2.4 间歇性PTHrP刺激对成牙骨质相关蛋白OPN、COL-1和IGF-1的蛋白表达的影响

在3个间歇性PTHrP(1-36)给药循环后，Western blotting法检测结果显示成牙骨质相关蛋白OPN、COL-1和IGF-1蛋白表达均明显增加(图4A)，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。在PTH1R阻断组，OPN、COL-1和IGF-1蛋白表达水平均受到不同程度的抑制，明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05，图4B)。

图4 间断性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3个周期后成牙骨质细胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1的蛋白质表达水平变化

3 讨论

PTHrP在人类及其他多种物种中广泛表达，通过自分泌、旁分泌及内分泌的形式作用于各个组织中，参与调控牙齿、乳腺及心脏血管的发育[1]。近年来研究[4, 8]显示甲状旁腺激素相关蛋白能够有效地促进骨组织的合成，加速骨愈合，表现更优于其他促骨组织修复的药物 。临床研究[3-4]发现对绝经后的妇女注射甲状旁腺激素相关蛋白PTHrP(1-36)，其骨形成标志物骨钙素和碱性磷酸酶的表达明显增高，骨密度明显增加。通过体外研究[9]发现，间歇性PTHrP能够刺激成骨样细胞中COL-1及OCN等成骨相关蛋白的表达，同时抑制细胞凋亡[10]，进一步促进矿化沉积。此外，以往研究[11]证实牙胚发育时，成釉器星网状层细胞和上皮细胞高度表达PTHrP，PTHrP作为一种程序性细胞分化的基因，与牙乳头细胞表面PTH1R相互作用，调控牙本质及牙釉质的形成，但PTHrP在成牙骨质中的作用尚未见报道。

本研究以体外培养成牙骨质细胞OCCM-30细胞为对象，发现间断性PTHrP刺激能降低成牙骨质细胞中凋亡细胞的百分比，凋亡早期和中晚期细胞比例均有减少，其中凋亡中晚期细胞的减少更加明显。另外，阻断PTH1R能诱导成牙骨质细胞的凋亡，说明PTHrP/PTH1R在成牙骨质细胞中起到了抑制细胞凋亡的作用。研究[2, 12-13]显示，间歇性PTH/PTHrP刺激可以抑制骨细胞和成骨细胞的凋亡，促进细胞存活，并发现PTH和PTHrP的抗凋亡作用一部分依赖于PTH1R，这些结果与本研究得到的结果一致。研究[14]显示，在成骨细胞中PTH1R可以通过与间隙连接蛋白connexin43及磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)相互作用，从而抑制成骨细胞凋亡。但PTHrP/PTH1R在成牙骨质细胞中抗凋亡的具体机制仍需进一步研究。

OPN和COL-1是牙骨质基质初始沉积过程中表达的矿化蛋白，与IGF-1相互作用，能够促进细胞后续的黏附、增生及分化，从而有助于形成牙骨质[15-16]。研究[17]显示,在牙骨质修复早期，在陷窝内及周围牙周组织细胞内均有OPN及COL-1表达，且OPN在新形成的牙骨质层的高表达优先于牙周膜细胞，能够促进成牙骨质前体细胞分化及牙骨质基质矿化。IGF-1通过促进牙周细胞增生、分化等细胞进程，能够促进牙周组织重建[18-19]。本研究结果显示，间歇性PTHrP可促进成牙骨质矿化相关蛋白OPN、COL-1和细胞因子IGF-1基因及蛋白的表达，同时发现阻断PTH1R可导致OPN、COL-1和IGF-1基因及蛋白水平下降，说明间歇性PTHrP能够促进成牙骨质矿化相关蛋白及生长因子表达增加，且这一过程是通过与PTH1R相互作用来完成的，这提示PTHrP/PTH1R信号系统能够抑制成牙骨质细胞凋亡，刺激成牙骨质细胞矿化过程，从而加快牙骨质的形成及修复。

与本研究结果不同的是，既往研究[20-22]显示，PTHrP促进牙周膜细胞中RANKL及OPG的表达，诱导破骨细胞增加，这种差异可能是由于PTHrP的给药方式不同导致的。早期研究[23]中PTHrP刺激均为持续性的给药方式，并且给药剂量较大，激活的是PTHrP的促进骨分解代谢的作用，而本研究采用间断式给药模式，发挥PTHrP/PTH1R抗凋亡，促进成牙骨质向合成代谢的作用。此外，有研究[24]证实体内间断性注射PTHrP能够有效抑制糖尿病大鼠牙槽骨的丧失及白细胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)炎性反应因子的表达，从而促进骨组织合成，但PTHrP作用于牙骨质的体内研究尚未见报道，后续仍需要相应动物实验进行验证。

综上，间断性PTHrP可通过与成牙骨质细胞上PTH1R相互作用抑制细胞凋亡，促进成牙骨质矿化相关蛋白及细胞因子的表达，发挥其促成牙骨质矿化沉积的合成代谢作用，促进牙根吸收的修复，从而为正畸引起的牙根吸收的预防和治疗提供新的思路。但关于PTHrP/PTH1R对成牙骨质细胞中抑制凋亡和促成牙骨质矿化的作用机制，还需进一步的研究。