李闰婷，陈龙欣，张丽萌，何海迎，王泳，杨若晨，段春辉，刘月琴，王玉琴，张英杰

粒细胞集落刺激因子在羊成纤维细胞中的表达及对细胞增殖和凋亡的影响

1河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001；2郑州师范学院分子生物学实验室，郑州 450044；3河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023

【】研究粒细胞集落刺激因子（granule cell stimulating factor，GCSF）在羊成纤维细胞体外培养中对其增殖、周期和凋亡的影响，为今后基于羊GCSF为靶标诱导全能干细胞进行分子遗传育种研究提供理论依据。将羊GCSF真核表达质粒pRTL1-GCSF和对照载体质粒pRTL1分别转染到1×105个细胞/mL的羊成纤维细胞中，培养48 h后，利用Trizol法分别提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测羊GCSF在羊成纤维细胞中的瞬时表达水平。通过GCSF依赖型细胞系NFS-60，利用细胞活力检测试剂alamarBlue测定转染48 h后羊成纤维细胞培养上清中分泌表达的GCSF的生物学活性。通过HEK 293F悬浮培养细胞系真核表达分泌型羊GCSF蛋白后，用Ni-NTA凝胶对细胞表达至细胞培养基中的GCSF蛋白进行纯化，并SDS-PAGE检测。加入纯化的30 ng·mL-1GCSF蛋白后在24和48 h时，通过alamarBlue测定羊成纤维细胞的增殖状态，利用流式细胞术检测羊成纤维细胞的细胞周期和凋亡变化。羊GCSF真核表达质粒转染羊成纤维细胞48 h，检测发现在羊成纤维细胞中GCSF表达量得到显著提高。在羊成纤维细胞中，转染了pRTL1-GCSF质粒的羊GCSF表达量是转染了pRTL1空载对照组的（50 615.92±4 738.83）倍（＜0.01）；羊成纤维细胞瞬时分泌表达的含有GCSF蛋白的培养基上清加入到GCSF依赖型细胞系NFS-60后，试验组和阳性对照组中的NFS-60的……