张鑫 刘阳 姜巍 王垂杰 李玉锋

摘要：目的 研究肝郁型功能性消化不良大鼠胃排空率以及胃和下丘腦组织Ghrelin 蛋白的表达变化，以探究和胃理气方对功能性消化不良干预的可能机制。方法 选取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200±20）g，随机分为空白组（10只）及模型组（30只）。空白组常规饲养，其余大鼠通过夹尾刺激法建立肝郁型FD大鼠模型，造模14 d。造模结束后按照随机数字表分为模型组、吗丁啉组、和胃理气方组（每组10只）。期间监测大鼠进食以及毛发、行为等一般状况。实验结束后，测量各组大鼠胃排空率，并通过Western blot法测定胃组织以及下丘脑组织Ghrelin蛋白表达。结果 模型组胃排空率明显低于和胃理气方组、吗丁啉组（P<0.05）;与模型组相比，和胃理气方组和吗丁啉组的胃及下丘脑Ghrelin蛋白表达增加（P<0.05）。结论 和胃理气方可能通过上调Ghrelin蛋白表达来有效干预功能性消化不良。

关键词：功能性消化不良;脑肠互动;胃;下丘脑;Ghrelin

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）04-0063-04

Effect of Hewei Liqi Decoction on Ghrelin Expression in Rats withLiver-Stagnation Type of Functional Dyspepsia

ZHANG Xin1， LIU Yang1， JIANG Wei2， WANG Chui-jie2， LI Yu-feng2

（1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China;2. The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang 110032， China）

【Abstract】Objective： To study the gastric emptying rate and the expression changes of Ghrelin protein in stomach and hypothalamus in rats with liver-stagnation functional dyspepsia in order to explore the possible mechanism of Hewei Liqi decoction on functional dyspepsia. Methods： 40 healthy Wistar rats were selected， half male and half male， and weighed （200±20） g. They were randomly divided into a blank group （10） and a model group （30）. The blank group was bred routinely and the rest of the rats were used to create a liver depression type FD rat model by the tail-clamping method， and the model was established for 14 days. After modeling， the rats were divided into model group， domperidone group and Hewei Liqi Decoction group （10 each group） according to the random number table. During this period， the general conditions of the rats' food intake， hair， behavior， etc. were monitored. After the experiment， the gastric emptying rate of rats in each group was measured and the expression of Ghrelin protein in gastric tissue and hypothalamic tissue was determined by Western blot. Results： The gastric emptying rate of the model group was significantly lower than that of the Hewei Liqi Decoction group and the domperidone group（P<0.05）. Compared with that of the model group， the gastric and hypothalamic Ghrelin protein expression in the Hewei Liqi Decotion group and the domperidone group increased （P<0.05）. Conclusion： Hewei Liqi Decoction may effectively interfere with functional dyspepsia by up-regulating the expression of Ghrelin protein.

【Key words】Functional dyspepsia;Brain-intestine interaction;Stomach;Hypothalamus;Ghrelin

功能性消化不良（functional gastriointestinal disease，FD）是全球范围内常见的功能性胃肠病之一，全球各国的消化不良患病率相差较大，总患病率约为11.5%～15.5%[1]。目前認为它是一种生物-心理-社会病症，其病因和发病机制还不是十分清楚，多考虑与遗传易感性、胃肠运动障碍、内脏敏感性增高、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染、中枢神经系统失调、黏膜免疫和炎症反应、脑肠轴异常及精神-心理社会因素等有关[2]。近年来随着对神经内分泌学说的深入研究，越来越多的学者认为脑肠轴在FD的发病中起着重要的作用[3]。由精神心理因素导致的FD患者除了有上腹部不适，早饱等胃肠道症状以外，还伴随着不同程度的焦虑紧张，而脑肠肽在此过程中有至关重要的作用。Ghrelin，又称促饥饿素或促生长素，是一种由28个氨基酸组成的内源性脑肠肽，是生长激素促分泌受体（GSHR）的天然内源性配体。主要由胃黏膜下层的 X/A 样细胞分泌。Ghrelin在乙酰基转移酶的作用下，变成有功能活性的酰基化Ghrelin，酰基化Ghrelin可通过血液及迷走神经，透过血脑屏障传递至下丘脑，与其受体GHSR-1a在弓状核结合，激活下丘脑神经肽Y（NPY）和刺鼠相关蛋白（AgRP）神经元，从而促进胃肠运动，增加摄食行为。功能性消化不良的中医病名对应“胃痛”、“胃痞”，其中肝郁型的发病过程与脑肠互动相对应[4]，肝失疏泄，情志不畅，忧思伤脾，导致脾运化不利，胃失和降而痞满。本实验旨在通过检测和胃理气方对FD大鼠模型的胃排空率及胃和下丘脑组织中Ghrelin的表达结果，探讨其对FD治疗作用机制，为以后临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取40只健康Wistar大鼠，雌雄各半，体质量（200± 20）g，随机分为空白组（10只）及模型组（30只）。

1.2 药物 和胃理气方：柴胡 15 g，党参 20 g，枳实 12 g，木 香 6 g，厚朴 12 g，陈皮 12 g，豆蔻 9 g，甘草 12 g。浓缩至每毫升相当于生药1 g;吗丁啉：以蒸馏水配制成 0.25 mg/mL的混悬液备用;生理盐水。

1.3 主要试剂 RIPA裂解液（强）：碧云天（货号P0013B）;5×蛋白电泳上样缓冲液：鼎国（货号WB-0091）;Bradford蛋白浓度测定试剂盒：碧云天（货号P0006）;蛋白预染marker：Bio-rad（货号161-0363）;SDS-PAGE凝胶配置试剂盒：碧云天（货号P0012A）;PVDF膜：Bio-rad（货号162-0177）;ECL显色液：Bio-rad（货号170-5060）;Ghrelin抗体：proteintech（货号13309-1-AP）;二抗（鼠）：CST（货号7076s）;二抗（兔）：CST（货号7074s）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备及分组 空白组常规饲养，模型组参照文献采用郭氏夹尾激怒法制备FD肝胃不和模型。每日2次，连续刺激14 d。每天夹尾时间固定[5]。造模结束后按照随机数字表分为模型组、吗丁啉组、和胃理气方组（每组10只）。

1.4.2 给药方法 造模结束日起开始给药。按药理学实验方法计算给药剂量，和胃理气方组给予和胃理气方40 g/kg/d（即4mL/100 g），吗丁啉组给予已配制的吗丁啉悬浊液0.01 g/kg/d（即0.001/100 g），空白对照组及模型组以等体积生理盐水灌胃。每日给药2次，连续14 d。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 实验期间每天观察大鼠的进食进水量，毛发，行为等变化。

1.5.2 检测大鼠胃排空率 各组动物用药结束时，禁食1 d，第2 d以10%酚红溶液灌胃，20 min后处死，剖腹、结扎贲门和幽门。取胃，沿胃大弯侧切开，以蒸馏水冲洗胃内容物，定容为6mL，加入0.15 mol/L的Ba（OH）2溶液2 mL搅拌混匀，静置10 min，再加入5%ZnSO4溶液2 mL振荡5 min，以3000 r/min离心10 min。吸取上清液4 mL，再加10%NaOH溶液0.5 mL混合，用分光光度计在560 nm波长下测定吸光度值（试验组A560），再测0.4%酚红溶液1 mL+1 mL蒸馏水+10%NaOH溶液0.5 mL的吸光度值（标准A560）。胃排空率计算公式：胃排空率（%）=（试验组A560-标准A560）/试验组A560*100%

1.5.3 Western blot法检测胃窦及下丘脑组织中Ghrelin表达 末次给药结束后24h禁食不禁水，断颈处死后暴露腹部，于无菌环境下取胃窦部组织及下丘脑组织，于-80℃保存。通过蛋白印迹法（Western blot）测定Ghrelin蛋白表达。使用Quantity One软件检测蛋白条带的灰度值，每个样品的目的条带灰度值与内参灰度值进行比较，然后再进行组间比较，最后得出目的蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件分析数据。计量资料以（x±s）表示。所有相关数据均作方差齐性检验和正态性检验，采用单因素方差分析和χ2检验，组间比较采用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状况 空白组大鼠一般状态良好，毛发光泽，活动灵敏，进食正常，大便呈球状。模型组大鼠进食明显减少，毛发变暗、枯黄、不顺，并有紧张、焦虑。和胃理气方组和吗丁啉组在治疗过程中，毛发渐渐恢复光泽，进食量和进水量逐渐增加，体质量均逐渐回升，和胃理气方组大鼠效果更明显。

2.2 和胃理气方对大鼠胃排空功能的影响 模型组大鼠胃排空率显著低于空白组;和胃理气方组和吗丁啉组大鼠胃排空率显著高于模型组;和胃理气方组大鼠胃排空率相比吗丁啉组更高（P<0.05）。见图1

2.3 各组大鼠胃黏膜组织Ghrelin蛋白表达比较 与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织Ghrelin蛋白表达水平显著降低，与模型组比较，和胃理气方组、吗丁啉组大鼠胃黏膜组织Ghrelin蛋白表达水平显著升高。与吗丁啉组比较，和胃理气方组无明显差异（P>0.05），见表1。

2.4 各组大鼠下丘脑组织Ghrelin蛋白表达比较 模型组大鼠下丘脑中 Ghrelin 蛋白表达明显低于正常组，和胃理气方组和吗丁啉组均可不程度地升高FD大鼠下丘脑中Ghrelin的含量，和胃理气方组稍高于吗丁啉组，见表1。

3 讨论

现在精神心理因素导致的FD已经引起广泛重视，而脑肠肽在此过程中具有重要作用。有大量研究表明Ghrelin具有促进食欲的作用。毛兰芳等[6]研究发现脑肠肽水平变化是引起胃肠动力障碍的最主要因素之一。陈苏宁等[7]研究证实 FD患者可能存在Ghrelin分泌异常，促胃动力药可能通过改变Ghrelin水平来促进胃肠运动。林亚平等[8]研究表示电针针刺“足三里”促进糖尿病胃轻瘫大鼠胃肠运动的作用机制可能与上调ghrelin的表达有关，说明外治法也可以使体内ghrelin含量变化。同时也有研究表示抑郁模型大鼠体内ghrelin 水平的异常升高，可能是对应激的一种反应，或许与 ghrelin 调控HPA轴相关[9]。薛香莉等[10]研究表示，ghrelin与GHSR结合可以产生抗抑郁效应，注射适宜剂量Ghrelin可产生抗焦虑行为。而Kazemi等[11]研究表明发现随着进食的时间变化，体内Ghrelin的含量也发生着动态变化，而Ghrelin与疾病状态之间的正相关或负相关取决于不同的测定方法以及是否排除了体内基础Ghrelin含量。另有国外学者研究表明，Ghrelin还能降低血清中内源性配体高迁移率族蛋白 1（HMGB1）水平并且改善肠黏膜屏障功能，通过刺激迷走神经减少肠道缺血-再灌注损伤。

本实验参照郭氏夹尾激怒法进行造模，在造模第四天大鼠进食明显减少，毛发变暗、枯黄，并有紧张、焦虑，提示造模成功。在给予和胃理气方和吗丁啉治疗后对比发现，模型组大鼠存在胃动力障碍和焦虑，和胃理气方组及吗丁啉药组能够加快FD大鼠的胃排空，提高胃窦组织及下丘脑组织Ghrelin的表达。本研究进一步证明Ghrelin的水平在FD 的发病中起重要作用。进一步推测和胃理气方对FD的治疗作用是通过增强胃动力、改善脑肠肽Ghrelin的正常分泌而实现的。然而影响Ghrelin表达的因素很多，包括饥饿、应激、血糖变化及机体其他激素的分泌等。本研究仅从大鼠胃排空功能和Ghrelin蛋白在胃窦及下丘脑表达水平探讨和胃理气方对FD的治疗机制，而是否有其他机制来改善肝郁型FD大鼠的症状还需要进行进一步实验研究。

《景岳全书·痞满》记载：“痞者，痞塞不开之谓;满者，胀满不行之谓。”指出“怒气暴伤，肝气未平而痞”。意为情志失调，气机郁滞，肝失疏泄，脾胃升降失调而为痞满。本课题组前期实验证实FD肝郁型发病过程中脑肠互动为重要环节[4]。治疗当以疏肝理气和胃。和胃理气方中柴胡用量大取其疏肝解郁之用，现代研究表示，柴胡有促进小肠推进的功能[12]。

党参补中益气，健脾生津，与柴胡配伍共为君药;枳实厚朴为行气消胀常用的对药，现代药理学证实厚朴中的酚类及枳实中的黄酮类物质都能不同程度促进胃排空。刘元素称木香散滞气，调诸气，和胃气。现代研究表明木香中木香烃内酯和去氢木香内酯可加速胃排空和增强胃动素的释放[13]。豆蔻化湿行气，温中止呕，右旋龙脑和右旋樟脑为其主要挥发油成分，可促进胃液分泌，促进胃肠蠕动。陈皮理气燥湿，健脾和胃，为脾胃之圣药;此五味药共为臣药。甘草益气健脾，缓急，调和诸药，缓诸药之峻猛，健脾胃之气，为佐使药。八味药共同达到疏肝理气，健脾除满之功效。

综上，本实验通过检测大鼠脑肠肽Ghrelin在下丘脑及胃组织的表达以及胃排空功能探讨了和胃理气方治疗肝郁型FD的机制，可以合理推测和胃理气方可能通过上调体内Ghrelin蛋白的表达，来调节肝郁型FD大鼠胃肠运动障碍及焦虑状态，从而发挥治療FD的作用，为中医药治疗FD提供有效依据。

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（收稿日期：2020-11-09）