梁桉婕，缪小兰，段 杉

（华南农业大学食品学院// 广东省功能食品活性物重点实验室// 广东省天然活性物工程技术研究中心// 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东 广州，510642）

由于消费习惯差异，我国消费者对鲜罗非鱼（Oreochromis）制品的接受度比冻结品更高，近年来一大批生鲜连锁店迅速成长，生鲜罗非鱼产品的开发符合当前形势要求。但普通贮藏温度（4 ℃）下罗非鱼保质期短，不适合生鲜销售；而冰温贮藏（Controlled Freezing-Point Storage，温度介于0 ℃和产品冰点之间）和微冻（Superchilled Storage，温度略低于产品冰点）可大大延长保质期[1]，适应生鲜销售要求。

冰温和微冻贮藏的温度已接近或超过多数细菌细胞的冰点，寒冷胁迫将导致细菌群落组成以及代谢活动发生显著变化。较普通贮藏条件下，能适应这种低温的细菌种类更少，本课题组[2]前期研究发现在0 和-3 ℃贮藏条件下的罗非鱼片与4 ℃的样品相比，细菌种类显著变少，腐败速度显著降低。

目前国家标准《鲜、冻动物性水产品标准（GB2733-2015）》中除了感官评价外，仅以TVB-N值作为评价淡水鱼鲜度的客观指标，但有研究认为TVB-N 值不适于衡量冰温和微冻贮藏条件下罗非鱼鲜度[3-7]，而目前国内外对于冰温和微冻贮藏条件下罗非鱼及其他水产品的腐败标志物的研究报道极少。因此，本研究通过测定4 ℃（普通贮藏）和-1.5 ℃（冰温及微冻贮藏）条件下罗非鱼的TVB-N值、菌落总数以及感官鲜度的变化，并采用电子鼻追踪挥发性成分的变化，探究罗非鱼的感官腐败程度与TVB-N 值和其他挥发性成分之间的相关性进行比较研究，分析两种贮藏温度下的腐败产物差异，查找罗非鱼在冰温和微冻贮藏条件下潜在的腐败标志物，以期为客观衡量相关罗非鱼制品的鲜度提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼（600～ 800 g）购于广州市长湴农贸市场。长虹美菱BCD-255WP3CX 冰箱；德国Airsense公司PEN3 电子鼻。

1.2 方法

1.2.1罗非鱼前处理 6 尾罗非鱼均购自同一市场。将新鲜罗非鱼宰杀、去头、去皮、去内脏，用自来水清洗干净，取肉切成小块，采用无菌保鲜盒包装。取3 尾置于（4±0.6）℃冰箱贮藏，0、1、2、3、4、5、6、7 d 分别采样检测；另外3 尾置于（-1.5±0.8）℃冰箱冰温贮藏，0、6、12、18、21、24 d采样检测。

1.2.2感官评价 感官评价小组由固定经过培训的5 人组成，采用打分和描述相结合的方法，分别针对罗非鱼的气味、色泽、质地打分，很新鲜0 分，新鲜1 分，一般2 分，略有腐败3 分，明显腐败4分，完全不可接受5 分；并对腐败特征进行描述，气味特征描述包括正常香味、鲜香、硫化氢味道、氨味、酸味以及腥臭味，色泽外观描述包括发暗、发红、光泽以及有无黏液，质地描述包括软烂程度、弹性、组织紧密程度以及纹理清晰程度。最后计算平均分。

1.2.3挥发性盐基氮（TVB-N）的测定 按照GB/T 5009.44—2003[8]微量扩散法，以每100 g 样品中所含氮的质量（mg）表示，每次测定3 个平行样品。

1.2.4可培养细菌数量的测定 按照GB/T 4789.2—2016[9]平板计数法操作：无菌条件下剪取10 g 鱼肉加入90 mL 灭菌生理盐水，摇床120 r/min 振摇30 min。取1 mL 菌悬液梯度稀释后采用计数培养基置于30 ℃培养48 h，计算菌落数，结果取对数值。实验进行3 次重复。

1.2.5挥发性成分的测定 采用电子鼻测定，称取搅碎的罗非鱼肉3.5 g，置于20 mL 进样瓶中，顶空平衡温度60 ℃，平衡时间15 min。电子鼻测定条件：注射针温度50 ℃，清洗时间100 s，进气量150 mL/min，测定时间120 s，特征值提取时间点设定为19～21 s，对特征时间段内的信息进行分析，每个样品均制备2 个平行样，结果去掉异常值，以确保实验数据准确性。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 26.0 进行处理，以平均值±标准差表示，并作单因素方差分析，显著性水平α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 不同贮藏温度下罗非鱼腐败的感官评价

由表1 可知，贮藏于4 ℃的罗非鱼至6 d 时腐败特征已很明显，7 d 时基本不可接受；贮藏于-1.5 ℃的罗非鱼至18 d 时腐败特征已很明显，21 d时基本不可接受，Cyprian 等[1]报道罗非鱼于-1 ℃贮藏20 d 后发生感官腐败，Laly 等[4]报道去内脏的罗非鱼在冰藏21 d 后发生感官腐败，本研究结果与上述结果很接近。

表1 贮藏于4 ℃和-1.5 ℃的罗非鱼感官评价分值Table 1 Sensory scores of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.2 不同贮藏温度下罗非鱼的TVB-N 值和细菌总数的变化

从图1 可以看出，4 ℃贮藏的罗非鱼的TVB-N值在0～ 6 d 变化较小，贮藏7 d 后迅速升高；而-1.5 ℃贮藏的罗非鱼的TVB-N 值在0～ 21 d 变化较小，贮藏24 d 后迅速升高。但无论是4 ℃还是-1.5 ℃贮藏的罗非鱼，至感官评价发生腐败时（分别为6 d 和21 d）其TVB-N 值仍未超过国家标准的限量规定（20 mg/100 g），此结果与Parlapani 等[3]、Laly 等[4]和Sørensena 等[7]的研究结果一致。菌落总数一直呈现上升趋势，4 ℃贮藏罗非鱼的可培养细菌数量增长较快，贮藏3 d 后已超过107cfu/g，5 d已达到109cfu/g；而-1.5 ℃贮藏罗非鱼菌落总数在贮藏6 d 后仍低于106cfu/g，15 d 才达到109cfu/g。上述结果与本课题组前期研究[2]以及Cyprian 等[1]、Laly 等[4]的报道相近。

-1.5 ℃贮藏下TVB-N 值及菌落总数的增长速度约为4 ℃下的3 倍，这与冰点温度附近对细菌的寒冷胁迫作用显著增强有很大关系。在细胞冰点温度附近，细菌会遭受诸如活性氧自由基浓度升高、膜流动性和酶活性下降、胞内水分结冰、蛋白质低温变性等伤害[10]，其对细菌生命活动的抑制作用是多方面的，与常温或普通贮藏温度下温度降低导致代谢速度下降的效应不能等同，因此-1.5 ℃与4 ℃相比，细菌的生长和腐败特征差异巨大。

此外，从图1 还可以发现TVB-N 值与菌落总数的增长并不同步，无论4 ℃还是在-1.5 ℃，均直至菌落总数达到109cfu/g 左右时TVB-N 才快速增长，这与细菌的群体感应有关，即菌落总数比较少的时候，细菌的腐败分解作用很弱，当数量增长到一定程度后细胞之间通过群体感应作用才表现出强烈的腐败作用[11]。

图1 贮藏于4 ℃和-1.5 ℃的罗非鱼的TVB-N 值和菌落总数变化Fig.1 TVB-N value and bacterial count of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.3 不同贮藏温度下罗非鱼挥发性成分的变化

由图2 可见，贮藏于4 ℃和-1.5 ℃的罗非鱼的挥发性成分差异很大，其中差异最明显的是氮氧化合物，贮藏于-1.5 ℃的罗非鱼的氮氧化合物含量呈现持续上升趋势，至腐败时含量远高于贮藏于4 ℃的罗非鱼；贮藏于-1.5 ℃的罗非鱼的甲基类化合物、无机硫化物、有机硫化物也随时间逐渐上升，且无论是含量还是变化趋势均与贮藏于4 ℃的罗非鱼有一定差异；贮藏于-1.5 ℃的罗非鱼的醇类和醛酮类化合物的变化则规律性较差。这是因为4 ℃贮藏罗非鱼细菌群落与冰温贮藏罗非鱼细菌群落的组成有明显差异[2]，此外，寒冷胁迫也导致细菌代谢活动发生显著变化，故4 ℃贮藏和冰温贮藏罗非鱼的挥发性成分也有所不同。以上各类挥发性化合物在贮藏初期均出现下降，然后稳步上升，推测这一现象的原因如下：0 d 为实验起点，此前罗非鱼一直处于室温，温度远高于4 ℃和-1.5 ℃，细菌代谢活动远比实验温度下强，产生的挥发性产物更多；实验开始后，罗非鱼肉中心温度大大降低，细菌代谢活动迅速降低，腐败产物的生成速度大幅下降；而且实验开始前细菌产生的挥发性成分大量挥发，新生成的挥发性成分暂时无法弥补挥发的损失，导致贮藏初期挥发性成分含量下降，随着贮藏时间延长，细菌大量增殖，产生的挥发性成分也稳步上升。

图2 不同贮藏温度下罗非鱼挥发性成分变化Fig.2 Volatile organic compounds of tilapia respectively stored at 4 ℃ and -1.5 ℃

2.4 不同贮藏温度下罗非鱼的TVB-N 值、菌落总数、挥发性成分及感官评价间的相关性分析

对TVB-N 值、菌落总数、挥发性成分以及感官评价的结果进行相关性分析，结果见表2。从表2 可发现，TVB-N 值与4 ℃贮藏罗非鱼的感官腐败评分显著相关（P＜ 0.05），但与-1.5 ℃贮藏罗非鱼的感官腐败评分相关不显著（P＞ 0.05），说明TVB-N 值并不能准确反映冰温和微冻贮藏罗非鱼的限度变化，这一结果与其他研究[3-7]的结果一致；此外，TVB-N 值与细菌数量之间的相关性也较低。

表2 TVB-N 值、菌落总数、挥发性成分与感官评价结果间的相关性分析Table 2 Correlation coefficients between TVB-N,bacterial counts,volatile organic compounds and sensory evaluation results

Parlapani 等[3]认为TVB-N 值仅适合于评价贮藏于较高温度下的鱼类鲜度，这可能因为与普通贮藏相比，-1.5 ℃贮藏鱼类的细菌群落及其代谢特征已发生明显变化，导致腐败产物不同；此外，贮藏或冻藏的鱼类的内源酶活动仍可导致TVB-N 值增加[12]，-1.5 ℃的低温对于细菌活动有显著抑制作用，但对生化反应速度的影响相对较小，因此，-1.5 ℃时鱼体内源酶活动产生的TVB-N 值占比大幅提高，与细菌性腐败的相关性下降。

4 ℃贮藏条件下，菌落总数与感官评价分数呈极显著相关（P＜ 0.01），但与各挥发性成分间的相关性较低。-1.5 ℃冰温条件下，细菌总数与感官评价分数、甲基类化合物均呈显著相关（P＜ 0.05）,甲基类化合物与气味、色泽评分呈显著相关（P＜0.05）。这一结果显示菌落总数仍可表征4 ℃和-1.5 ℃温度下贮藏罗非鱼的鲜度，甲基类成分具有作为冰温或微冻贮藏罗非鱼腐败标志物的潜力，但本研究所用样本量有限，是对冰温或微冻贮藏罗非鱼腐败标志物的初步筛选，后续需要通过增加样本量以及改变实验条件以进一步研究确认。

3 结论

4 ℃时，TVB-N 值与感官评价结果的相关性较高，适合作为罗非鱼的鲜度评价指标；但在-1.5 ℃时，TVBN 值与感官评价结果的相关性不高，说明在该温度附近TVB-N 值不适于作为罗非鱼的鲜度指标。贮藏于4 ℃和-1.5 ℃的罗非鱼的挥发性成分也相差很大，-1.5 ℃的罗非鱼的氮氧化合物含量呈现持续上升趋势，至腐败时含量远高于贮藏于4 ℃的罗非鱼，其他挥发性成分也有显著差异。贮藏于-1.5 ℃的罗非鱼腐败气味感官评分与氮氧化物、无机硫化物、有机硫化物含量的相关性良好，而与甲基类成分呈显著相关。显示甲基类成分具有作为冰温贮藏罗非鱼腐败标志物的潜力。