孙 东，陈 琪，朱 博，段美娜

（1.广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088；2.暨南大学生命科学技术学院，广东 广州 510632；3.西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

有害藻华（harmful algal blooms,HABs）频发于世界各地沿海，对水产养殖业、旅游业等造成严重的经济损失，甚至威胁到海洋生态安全和人类健康，已经成为国际社会共同关注的重大海洋环境问题和生态灾害[1-2]。据不完全统计，HABs 在全球范围内每年可造成约80 亿美元的经济损失[3]。米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi）是一种典型的有害甲藻，是一种常见的鱼毒性赤潮藻，属于甲藻门，裸甲藻目，凯伦藻属，分布广泛，常在太平洋沿岸[4]、印度洋和中国东南海暴发形成HABs[5]。我国东海从2002 年开始，几乎每年暴发米氏凯伦藻藻华，造成鱼类、贝类和其他海洋无脊椎动物的大量死亡[6]，已经严重威胁到近岸海洋生态系统的安全。

应对HABs 的措施大致分为两类，即预防HABs 发生和在HABs 发生时进行控制。大量用于防治和控制赤潮发生的研究集中在物理、化学和生物学方法[7]。其中，海洋植物（藻类等）、沉水植物和红树植物的代谢产物（化感物质）等生物学方法具有污染程度小、容易降解、对近海海洋生态系统微生物群落干扰较小[7]等特点，为防治和控制HABs的发生提供新的方向[8]。

原儿茶酸（protocatechuic acid，PA）存在于多种红树植物中，海芒果（Cerbera manghas）中含有大量的PA[9-10]。PA 具有抗癌、抗衰老、抗病毒、抗菌，以及保护肝脏、肾脏的功能[11]，与其他酚酸类物质可以通过植被腐烂、植物根系分泌等方式释放到海洋坏境中[12]。叶绿体是决定藻类光合能力的关键，其对环境胁迫最为敏感[13]。有研究发现，化感物质可以促进自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生成，进而对藻细胞的细胞器产生损伤。当持续暴露或者化感物质浓度较高时，细胞无法清除自由基和活性氧，因此，藻细胞表现出氧化损坏或死亡的情况[14-15]。同时，多环芳烃和重金属等污染物可破坏植物叶绿体，降低光合效率[16-17]，而光合能力的强烈抑制势必会延缓藻类的生长和发育，达到抑制藻类生长的目的，进而控制赤潮发生。

为了探讨红树植物及其主要抑藻物质对赤潮藻的抑制效应，以及对赤潮藻的光合系统PSⅡ的抑制机制，本研究开展了红树植物果实水提液及其主要抑藻物质对米氏凯伦藻生长、光合系统PSⅡ的抑制作用及机制研究，探寻不同浓度水提物和抑藻物质对赤潮藻光合作用的生理学差异，阐明红树植物及其主要抑藻物质对赤潮藻的生理学机制，以期为防治赤潮发生提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 赤潮藻的实验室培养

实验藻种米氏凯伦藻（Karenia mikimotoiGY-H36）购置于上海光语生物科技有限公司，保种于暨南大学生命科学技术学院。

藻种培养：接种于f/2 灭菌培养基中（表1），培养于人工气候培养箱（新苗GZX-300BSH-Ⅲ，上海），其中海水配制采用人工海盐（Dragon King，广州）配制盐度为 29±1。照度设置为 100 μmol·m-2·s-1，光暗周期比12 h∶12 h，温度为（20±1）℃，每天轻轻摇晃并交换位置3 次。

1.2 海芒果果实水提物的制备

海芒果（C.manghas）果实采集于珠海市淇澳岛红树林自然保护区。新鲜果实收集后，用蒸馏水洗净，擦拭干净，去果核，再经-80 ℃冷冻干燥（Wizard 2.0，Virtis，美国），用打粉机将冻干后的果实打成干粉备用。

称量100 g 海芒果干粉加入到2 L 已灭菌的f/2培养基中。混合物封口后经70 ℃水浴加热24 h，再超声处理2 h，得到浑浊的褐色水提物。把该水提物经过滤纸过滤除渣，再经过孔径0.22 μm 滤膜过滤以去除微生物，4 ℃下避光保存。母液浓度为50 g·L-1。

1.3 海芒果提取物抑藻率的计算

将海芒果果实水提物母液（50 g·L-1）按梯度稀释至0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1，总体系为50 mL（表2）。米氏凯伦藻接种浓度为4.5×104L-1，每组设置3 个平行。每日取样1 mL 用体积分数4%的甲醛固定进行细胞计数。计算抑制率IR，公式如下：

表2 海芒果提取物抑藻率实验设计Table 2 Experimental design of algae inhibition

1.4 原儿茶酸母液的制备

购买原儿茶酸（TargetMol，美国，99.9%，CAS:99-50-3）标准品用于后续实验。配置10 g·L-1的母液，按梯度稀释至25、50、75、100、125 mg·L-1，总反应体积为50 mL。抑制率计算方法同1.3 节。

1.5 叶绿素快速荧光参数的测定

取2 mL 藻液于植物效率仪反应杯中，室温下遮光暗适应20 min。采用手持式植物叶绿素快速荧光仪（Handy Plant Efficiency Analyzer,Handy PEA,Hansatech,英国）检测叶绿素荧光动力学参数。

Handy PEA 使用过程：设置参数 3 000 μmol·m-2·s-1，增益为1.0×。用f/2 培养基将仪器调零后，将反应杯放入液体检测器中，测定叶绿素荧光诱导动力学（OJIP）指标。通过分析得到OJIP曲线及相关光合系统Ⅱ电子传递相关参数。JIP-test相关参数和计算公式[19-20]见表3。

表3 JIP-test 相关参数和计算公式Table 3 Parameters and formulas of JIP-test

1.6 统计分析

所有实验结果为3 组平行实验分析所得，并采用平均值±SD 表示。组间差异显著性分析采用One-way ANOVA 和LSD（SPSS statistics 25，IBM）进行统计分析，P＜ 0.05 为差异显著。使用origin 8.5进行分析制图。

2 结果与分析

2.1 海芒果果实水提物及其抑藻物质对米氏凯伦藻生长的影响

海芒果果实水提物可显著抑制米氏凯伦藻的生长（图1_A），且呈现出“低浓度促进、高浓度抑制”现象以及典型的“剂量-效应”关系，即低质量浓度（0.625 g·L-1）时促进藻类生长，当质量浓度逐渐升高时，抑制率显著增加。图1_B 显示，在海芒果果实水提物质量浓度为5 g·L-1，暴露120 h时，对米氏凯伦藻的抑制率为（99.87±0.04）%，已经达到完全抑制的效果。原儿茶酸对米氏凯伦藻也有显著的抑制效应（图1_C），在暴露120 h 时，质量浓度为25、50 mg·L-1的原儿茶酸对米氏凯伦藻出现了显著的抑制作用，但原儿茶酸质量浓度为25 mg·L-1时抑制率较低，为（17.82±2.58）%（图1_D）。随着质量浓度的升高，其抑制率逐渐增加，至75 mg·L-1时，已经出现了完全抑制效应。

图1 海芒果果实水提物及其只要抑藻物质原儿茶酸对米氏凯伦藻的生长影响及120 h 抑制率Fig.1 Growth and 120 h inhibitory effects of fruit water extract and PA of Cerbera manghas L.on Karenia mikimotoi

2.2 海芒果果实水提物对米氏凯伦藻光合作用的影响

图2 描述了海芒果果实水提物对米氏凯伦藻光合系统Ⅱ相对荧光值的影响。随暴露时间的延长，米氏凯伦藻相对荧光值逐渐增加。在暴露48、72 h时，0.625、1.25 g·L-1的海芒果果实水提物对米氏凯伦藻的影响出现典型的“低浓度促进、高浓度抑制”的现象。10 g·L-1的海芒果果实水提物出现了最高抑制光合系统Ⅱ相对荧光产量的情况，在48 h时，其J-I-P相迅速下降；在120 h 时，荧光产量几乎完全消失。

图2 海芒果果实水提物对米氏凯伦藻叶绿素快速荧光动力学曲线的影响Fig.2 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to fruit water extract for Cerbera manghas

为进一步了解海芒果果实水提液对米氏凯伦藻光合系统Ⅱ的影响，通过公式计算得到JIP-test相关数据进行分析，并得到以下结果（图3）。反应中心密度指标RC/CS0在高质量浓度组（5、10 g·L-1）均显著低于对照组，且随质量浓度上升而下降。单位激发界面能量通量相关指标（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在高质量浓度组，120 h 时均出现了不同程度的下降，且随着质量浓度的上升而下降。与QA还原光合系统Ⅱ反应中心能量通量的数据显示，120 h 时，TR0/RC 无显著差异，高质量浓度处理组（5、10 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均显著低于对照组。荧光产量和通量比相关指标φP0、φE0和0ψ中，中高质量浓度组（2.5、5 g·L-1）φE0和0ψ出现上升的趋势，而10 g·L-1的处理组则显示出下降的现象；φP0则表现出随着质量浓度增加，值也相对增加的情况。

图3 海芒果果实水提物对米氏凯伦藻叶绿素a 荧光瞬时-JIP 参数的影响Fig.3 Effect of fruit water extract for Cerbera manghas on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

2.3 原儿茶酸对米氏凯伦藻光合作用的影响

海芒果果实水提物中抑藻物质含量较多的原儿茶酸对米氏凯伦藻光合系统Ⅱ相对荧光值的影响（图4）。随着暴露时间延长，米氏凯伦藻的相对荧光值逐渐增加。原儿茶酸抑藻过程中并未出现海芒果果实水提物“低促高抑”现象。在24 h 时，125 g·L-1处理组中J-I-P 相迅速下降，且随着时间延长而逐渐降低。其他各组均随着质量浓度的升高，其相对荧光值出现了逐渐下降的趋势。120 h 时，50 g·L-1的原儿茶酸就已经对米氏凯伦藻出现显著的抑制情况。

图4 原儿茶酸对米氏凯伦藻叶绿素快速荧光动力学曲线的影响Fig.4 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to Protocatechuic acid

反应中心密度指标RC/CS0在中高质量浓度组（25～ 125 g·L-1）均显著低于对照组（图5_E），且随质量浓度上升而下降，同时，25 g·L-1的RC/CS0略高于对照组。单位激发界面能量通量相关指标（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在中高质量浓度组（25～ 125 g·L-1），24～ 120 h 时，均出现随质量浓度的上升而下降现象（图5_B-E）。与QA还原光合系统Ⅱ反应中心能量通量的数据显示，120 h 时，高质量浓度组（125 g·L-1）TR0/RC 出现增加现象，其他各处理组均无显著变化。高质量浓度组（125 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均显著高于对照组，其他组与对照组均无显著变化。荧光产量和通量比指标中，φP0无显著变化。中质量浓度组（50、75 g·L-1）φE0和0ψ出现上升趋势，高质量浓度组（125 g·L-1）则显示下降现象。

图5 原儿茶酸对米氏凯伦藻叶绿素a 荧光瞬时-JIP 参数的影响Fig.5 Effect of Protocatechuic acid on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

3 讨论

本研究结果表明，海芒果果实提取物及其主要化感物质可显著抑制常见赤潮藻米氏凯伦藻的生长，且能干扰米氏凯伦藻光合效能。相关研究也证实许多植物的组织、提取物、分泌物和代谢产物等可抑制藻类生长[21-23]。海芒果为一种半红树植物，我国东南沿海、南海北部沿岸均广泛分布，其生态位与赤潮藻暴发时期的生态位部分重叠。因此，海芒果在赤潮防治中有独特的研究空间和研究价值。

化感物质会影响藻类光合系统，甚至会影响到ATP 的合成[24]。本研究也发现，随着浓度的逐渐升高，米氏凯伦藻的荧光动力学曲线J-I-P 相明显下降，说明海芒果果实水提物和PA 均会抑制米氏凯伦藻的光系统PSⅡ的光活化。有研究发现，I-P 相降低是因为QB非还原中心比例增加导致的QA到QB的电子转移受阻而引起的[25]。且随着浓度的增加，F0、Fi、Fj和Fm均出现逐渐降低的情况，说明PSⅡ供体侧的电子转移受阻逐渐严重[26]。F0的逐渐降低可能是藻密度降低所引起的，然而O-I-J 相的降低可能是因为PSⅡ中天线复合体结构受损，同时抑制了PSⅠ的活性，进而导致电子转移受阻[27-28]。这与本课题之前的研究结果相类似[19]，也与其他重金属、多环芳烃、高温等胁迫的研究结果相似[29-30]。因此，可推断海芒果果实水提物和PA 与可能导致米氏凯伦藻光系统PSⅡ的供体和受体侧结构和功能受损，天线复合体电子传递受阻有关。

中高质量浓度组ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0等参数的降低，表明水提液和PA 能够抑制米氏凯伦藻光合系统对电子的吸收、电子传递；而DI0/RC 和ABS/RC 的增加，则表明了耗散和每反应中心吸收值的增加。笔者此前的研究发现，在96 h时，稀土元素镧对微藻的DI0/RC 和ABS/RC 并无显著变化[19]。有研究显示，ABS/RC 的增加表明了反应中心失活，或者反应中心PSⅡ受到抑制或损伤[30]，而ABS/RC 的增加往往会导致DI0/RC 的增加，而DI0/RC 的增加进一步导致ROS 的产生，引起光合器的过氧化损伤[31]。因此，可推测高质量浓度组的DI0/RC 增加加速了ROS 的产生，引起了光合器的过氧化损伤加重；而中低质量浓度组DI0/RC 降低可以有效缓解胁迫带来的过氧化损伤，这可能是米氏凯伦藻受胁迫后的一种自我调控保护机制。此外，PA 处理组中光合性能指数（Performance Index，PI）φE0和0ψ下降可能由光合系统中能量吸收、捕获和电子转移受阻引起[32]。

4 结论

本研究证明海芒果果实水提物及其主要物质原儿茶酸可以有效抑制米氏凯伦藻的生长。米氏凯伦藻受到胁迫后，其光合系统Ⅱ的反应中心密度、单位激发界面能量通量和QA还原光合系统反应中心均发生了变化，最终导致光合系统电子传递和电子吸收障碍，进而导致米氏凯伦藻生长受到抑制。这些结果表明海芒果及原儿茶酸可以作为一种有效防治赤潮发生的天然抑藻物质，以期为我国近海岸赤潮防治提供基础数据。