刘剀剡 丁 勤 袁梦玹 浦跃朴

(东南大学环境医学工程教育部重点实验室, 南京 210009)

微囊藻毒素(Microcystins,MCs)是淡水中常见的具有肝肾毒性的藻类毒素[1-2],亚洲湖泊和河流中最主要的MCs变体为微囊藻毒素-RR(Microcystin-RR,MC-RR)和微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)[3].人类活动和全球变暖使得自然水体温度逐年升高,水体富营养化愈发普遍,MCs污染情况日趋严重[4-6].

微生物降解是清除水体MCs的主要途径[7-8],鞘氨醇单胞菌(Sphingopyxissp.)是发现最早、研究较多的MCs降解菌[9].鞘氨醇单胞菌通过4种MCs降解基因(mlrA、mlrB、mlrC和mlrD)编码的4种蛋白酶(MlrA、MlrB和MlrC和MlrD)发挥作用,其中MlrA作为细菌降解MCs的起始酶而受到重点关注[10-14].已有研究[14-16]表明,细菌降解MCs与水体温度、营养基质浓度、pH值及有机污染物种类等因素有关,但影响因素的作用途径及机制尚未见报道.

本文以携带4种MCs降解基因的鞘氨醇单胞菌m6为研究对象,旨在通过对不同条件下MC-RR浓度、降解产物、基因mlrA及酶MlrA活性的检测与分析,探究鞘氨醇单胞菌对MC-RR的降解能力、影响因素和作用机制,为生物降解MCs技术的现实应用提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

本文所用主要试剂和仪器如下:MC-RR纯品(质量分数大于等于95%,中国台湾藻研)；LB肉汤(中国青岛海博)；高效液相色谱仪(HPLC,1260,美国安捷伦),超高效液相串联多级质谱仪(UPLC-MS/MS,triple TOF 5600+,美国爱博才思),实时荧光定量PCR仪(7500,美国赛默飞世尔)；无机盐液体培养基(MSM培养基),包含1.0 g/L MgSO4·7H2O,0.5 g/L KH2PO4,4.0 g/L K2HPO4,1.0 g/L NaCl,0.02 g/L CaCl2,0.005 g/L FeSO4,0.005 g/L MnCl2·4H2O,0.005 g/L ZnCl2,0.000 5 g/L CuCl2,pH=7.0.

1.2 鞘氨醇单胞菌降解MC-RR

取m6菌株单克隆于LB肉汤中培养36 h,4 ℃ 5 000 r/min 离心10 min收集菌体,去离子水洗涤2次后重悬于1.0 mg/L MC-RR的MSM培养基中,置于30 ℃ 150 r/min摇床……