王思文,娜仁图雅,籍学伟*

(1.呼和浩特市食品药品检验所，内蒙古自治区 呼和浩特 010000；2.内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古自治区 呼和浩特 010020)

蒙医药作为传统医药重要组成部分，千百年来为守护蒙古族人民的身体健康作出了重要贡献，蒙医药也以其独特的疗效越来越被大家所关注。 三子散[1]作为传统蒙医成方制剂便是其中之一，本方是由诃子、川楝子、栀子三味药材制成，收载于《中国药典》2015年版一部，具有清热凉血和解毒的药理作用，可用于温热、血热、新久热。诃子作为方中主要药味，其性苦，酸，涩，平，归肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽、强身健体、增强脾胃消化等功效[2]。据文献报道，诃子中化学成分较为丰富，主要包括酚酸类、鞣质类、三萜类、黄酮类等[3]。本次试验采用高效液相色谱法以诃子中没食子酸为指标性成分建立了三子散含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

岛津LC-20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PL-203梅特勒-托利多电子天平(千分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)；Mettler AE-100型电子天平(万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司)；Sartorius ME 5型电子天平(百万分之一，赛多利斯仪器有限公司)。

三子散(乌兰浩特中蒙制药有限公司，批号190630；内蒙古蒙药股份有限公司，批号2001043、2002029、1907055、1907056；内蒙古库伦蒙药有限公司，批号191251、190706、180444)。

没食子酸对照品(批号110831-201906)，购自中国食品药品检定研究院；模拟样品为自制；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(5∶95)；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样体积：10μL；检测波长：273nm。

2.2 对照品溶液的制备

取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含70μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取三子散约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率300W ，频率40kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例及制备工艺制成不含诃子的阴性样品，照“2.3”项下方法制备缺诃子的阴性对照溶液，即得。

2.5 专属性试验

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10μL，分别按“2.1色谱条件”进样并记录色谱图。供试品呈现与对照品保留时间相同的色谱峰，阴性对照在相应位置无色谱峰。色谱图见图1。

A.对照品 B.供试品 C.阴性对照品

2.6 线性关系的考察

取没食子酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成浓度为0.7mg/mL的对照品储备溶液。分别精密吸取上述储备液0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL置10mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行回归分析。结果表明：没食子酸在6.357μg～158.935μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=31624x+14985，R=0.999。

2.7 稳定性试验

取同一供试品(批号2001043)并于供试品溶液制备后0、2、4、6、8、12、24h测定含量以考察溶液的稳定性。结果显示，在不同时间点测得没食子酸峰面积的RSD为0.15%。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 精密度试验

取同一供试品溶液(批号2001043)，连续进样6次，测定没食子酸峰面积积分值。结果没食子酸峰面积的RSD为0.45%。表明仪器精密度良好。

2.9 重复性试验

取同一供试品(批号2001043)6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图并计算没食子酸的含量。没食子酸的平均含量为3.14mg/g，RSD为1.18%。表明方法的重复性好。

2.10 加样回收试验

取已知含量的供试品(批号2001043)6份，每份约0.25g，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中。精密加入浓度为80.2μg/mL的没食子酸对照品溶液10mL(相当于供试品含有量的100%)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算回收率。结果没食子酸的平均加样回收率(n=6)为97.70%，RSD为1.30%。结果见表1。

表1 加样回收试验结果(n=6)

2.11 供试品测定

取8批样品，各约0.5g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1” 项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算没食子酸的含量，结果见表2。

表2 供试品含量测定结果

本次研究按照拟定的方法对三家生产企业共8批次样品进行了含量测定。结果显示，不同厂家产品的没食子酸含量之间有差异。此外，同一家生产企业同一年度内生产的样品，其含量测定结果相对稳定；不同年度生产的样品，测定结果存在一定的差异。分析原因可能是不同生产企业使用了不同来源的诃子药材使得含量有所差异，具体原因有待进一步考察研究。

3 讨论

3.1 流动相的选择

参照标准“那如三味丸”项下的含量测定方法[5]，以甲醇-0.1%磷酸溶液(2∶98)为流动相进行测定。根据《中国药典》2015年版四部通则“高效液相色谱法”项下规定，用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定[6]。在测定过程中，考察了流动相甲醇-0.1%磷酸溶液比例(8∶92)和(5∶95)，结果表明以甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)作流动相时色谱分离效果更好[7-10]。因此，选择了甲醇-0.1%磷酸溶液(5∶95)为流动相。

3.2 提取溶剂及方法的选择

试验分别采用50%甲醇、75%甲醇、甲醇作为提取溶剂，考察提取效果，结果表明，用50%甲醇提取的效果最佳；试验对回流提取、超声提取和振摇提取进行了比较，结果表明，回流提取与超声提取效率高且相似。考虑到方法的简便易行，确定采用超声提取方法[11-15]。通过对不同提取时间的考察发现，超声处理30min后，没食子酸的含量基本不再增加，故确定超声时间为30min。

3.3 总结

本文采用高效液相色谱法建立了测定三子散中没食子酸的含量测定方法，该法操作简便，过程容易控制，重复性、精密度、稳定性、回收率结果均较佳，阴性对照无干扰，可作为进一步提高三子散质量的方法。