王晓， 黄晓平， 刁勇

(1. 华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021； 2. 华侨大学 生物医学学院， 福建 泉州 362021)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是一种内源性分泌肽，在外源细胞凋亡途径中与跨膜死亡配体受体DR4，DR5结合，激活DR4，DR5分子胞浆的死亡结构域，并通过激活胱天蛋白酶(caspase)级联反应，引起细胞凋亡.级联反应中的Fasl和TNF-α都有促进细胞凋亡的作用，但Fasl会导致致命的肝损伤，而TNF-α可能会导致炎症反应[1-2].TRAIL特异性地诱导肺癌、乳腺癌等多种癌细胞凋亡，且不会诱导正常细胞凋亡.临床数据显示,TRAIL产生耐药性与蛋白激酶和受体有关[3-4].联合用药既可以增强抗肿瘤活性又可以避免产生耐药性，成为TRAIL用于肿瘤治疗的研究方向.

组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗肿瘤作用[5-6].将kallistatin与TRAIL联合使用是否会增强TRAIL的抗肿瘤活性，目前还未见相关报道.因此，本文设计pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL重组载体，通过内部核糖体进入位点序列(IRES)同时表达TRAIL与kallistatin，经细胞活力和细胞凋亡实验验证TRAIL与kallistatin联合使用的抗肿瘤活性.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

菌种、细胞株和质粒E.coilDH5α，pAM-CAG，pIRES-eGFP，pCDNA3.1-Kal，pCDNA3.1-TRAIL 为本实验室保存；A549，LO-2，NCI-H446和Hela细胞株购自ATCC细胞库.

HindⅢ,EcoRⅠ,SpeⅠ,BamHⅠ等限制性内切酶、T4 连接酶、Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(北京天根生物科技有限公司)；兔抗kallistatin、鼠抗TRAIL单克隆抗体，羊抗兔、羊抗鼠二抗(英国Abcam公司)；kallistatin，TRAIL酶联免疫试剂盒(ELISA，美国R&D公司)；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司).

表1 扩增目的基因的PCR引物Tab.1 PCR primers for amplifying target gene

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的扩增 根据GenBank 报道的TRAIL,IRES,kallistatin基因……