刘芹 胡素娟 孔维丽 崔筱 袁瑞奇 孔维威 邱立友

摘 要：为了解玉米芯粒径对平菇栽培用发酵料中代谢物的影响，采用代谢组学技术分析添加不同粒径玉米芯的发酵料中微生物代谢物及其代谢通路。结果表明，添加小粒径玉米芯（D50 = 0.5 cm）和大粒径玉米芯（D50 = 1.5 cm）的发酵料中微生物代谢物差异显著。在正离子（POS）和负离子（NEG）模式下分别筛选得到464种和201种差异代谢物，包括芳香族化合物、氨基酸、糖及醇类、脂质、生物碱等。差异代谢物分别富集到90条（POS模式）和94条（NEG模式）代谢通路，差异显著的有2条，分别为源自鸟氨酸、赖氨酸、烟酸生物合成生物碱和组氨酸代谢。说明不同粒径玉米芯发酵料中微生物代谢物具有显著差异，为发酵料栽培平菇原料选择提供了理论依据。

关键词：平菇;发酵料;玉米芯;代谢组;差异代谢物

Abstract： Metabolomics technique was used to analyze the differences of microbial metabolites in fermentation materials for Pleurotus ostreatus cultivation adding corncobs with different particle sizes. Results showed a significant difference between microbial metabolites in fermentation materials adding small particle （D50 = 0.5 cm） and large particle （D50 = 1.5 cm） of corncobs. 464 and 201 differential metabolites were screened at POS and NEG modes， respectively， including aromatic compounds， amino acids， sugars and alcohols， lipids， alkaloids. The analysis of KEGG metabolic pathway showed that differential metabolites were enriched in 90 （POS mode） and 94 （NEG mode） metabolic pathways， respectively， and two of which were significantly different. They were Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine， lysine and nicotinic acid and Histidine metabolism. The results indicated that there were significant differences between the microbial metabolites in the fermentation materials adding corncobs with different particle sizes， which provided important information for the selection of cultivation materials and the improvement of cultivation techniques of P. ostreatus.

Key words： Pleurotus ostreatus; Fermentation material; Corncob; Metabolomics; Differential metabolite

平菇（Pleurotus ostreatus）是世界上栽培最广泛的食用菌之一[1]，由于其丰富的营养（如蛋白质、矿物质和维生素），显著的抗氧化、抗病毒、提高免疫力等生物活性而受到消费者的青睐[2]。平菇易于栽培，可以在各种农业副产物（玉米芯、秸秆、麸皮等）上生长，其年产量在世界范围内持续快速增长[3]。目前平菇的栽培技术主要分为3种：生料栽培、熟料栽培和发酵料栽培[4-5]。与生料栽培和熟料栽培相比，发酵料栽培因其低污染、低成本、工艺简单、经济效益高等优点而在世界范围内广泛应用[4]。平菇栽培用发酵料是以秸秆、玉米芯等农业副产物为主要原料，加入少量的麸皮、石灰等，在微生物的参与下，经短期、好氧发酵而制备的[1]。玉米是我国三大粮食作物之一，玉米芯约占玉米产量的21%，是一种产量巨大的农副产品，来源广泛、价廉易得[6-7]。目前，玉米芯除用于制备糠醛、木糖醇等外，很大一部分被作為农业废弃物直接燃烧，造成资源浪费和环境污染。玉米芯组织均匀、硬度适宜、吸水性强，将其堆制发酵后用于平菇栽培，不仅有助于平菇产量和品质的提高，而且可以实现农业副产物的高效生物转化[7]。

微生物在发酵料制备过程中起着重要的作用，微生物群落动态变化影响有机物的降解，而有机物的降解决定了发酵的成熟度[8]。微生物能将培养料中复杂的有机质（纤维素、半纤维素、木质素等）进行降解，使其变成简单、易于利用的小分子物质，从而为平菇生长提供营养物质;有些特定微生物如Actinobacteria、Thermus和Bacillus还可以产生抗菌、杀虫的物质，为平菇生长创造一个适宜的环境[9]。河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所食用菌创新团队前期研究发现，不同粒径的玉米芯持水率、孔隙度等物理性质的不同导致发酵料升温开始时间、高料温保持时间、发酵周期及菌袋污染率等显著不同，这些指标影响了发酵料质量。发酵料质量与其中微生物的活动和代谢产物有关，目前还未有不同粒径玉米芯发酵料制备过程中微生物代谢差异的研究报道。

同时采用200次响应的置换检验来验证模型的过拟合现象，避免采用OPLS-DA方法进行分析时出现过拟合。图3为OPLS-DA模型的置换检验结果。Q2的回归直线与y轴的交点在负半轴;POS模式R2Y（cum）（0.0，0.84），Q2（cum）（0.0，-0.84）;NEG模式R2Y（cum）（0.0，0.73），Q2（cum）（0.0，-1.02）。这表明建立的OPLS‐DA模型是稳健可靠的，不存在过拟合现象。因此，可以用于分析不同粒径玉米芯发酵料中代谢物的差异性。

2.2 差异化合物的筛选与分析

以p<0.05和VIP>1为条件筛选出具有差异性表达的化合物，在POS模式下筛选鉴定得到464个差异代谢物，其中上调代谢物为214种，下调代谢物为250种（图4-a）;在NEG模式经过筛选鉴定得到201个差异代谢物，其中上调代谢物为111种，下调代谢物为90种（图4-b）。

对筛选到的差异代谢物进行log2处理，变化最显著的40种（上调和下调）差异代谢物见图5。与小粒径玉米芯发酵料相比，大粒径玉米芯发酵料中咖啡酸甲酯（Methyl caffeate）、顺-2-癸烯酸（cis-2-Decenoic acid）、2-乙基-2-苯基丙二酰胺（2-Ethyl-2-phenylmalonamide）、4-乙氧基苯甲醛（4-Ethoxybenzaldehyde）、核酮糖-5-磷酸（Ribulose-5-phosphate）、炔诺醇（Nirvanol）、异戊烯基腺嘌呤（Isopentenyladenine）等物质的含量显著增加，而1-（2-呋喃基）戊烷-1，4-二酮（1-（2-Furyl）pentane-1，4-dione）、吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid）、3-（4-羟基苯基）丙酸（3-（4-Hydroxyphenyl） propionic acid）、5-甲氧基吲哚-3-甲醛（5-Methoxyindole-3-carbaldehyde）、苯乙醛（Phenylacetaldehyde）、4-羟基-3-甲氧基苯基乙二醇硫酸盐（4-Hydroxy-3-methoxyphenylglycol sulfate）、氢化肉桂酸（Hydrocinnamic acid）、4-乙基苯酚（4-Ethylphenol）等物质含量显著降低。

2.3 差异代谢物的代谢通路富集分析

将不同粒径玉米芯发酵料中的差异代谢物导入KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行代谢通路富集分析，共计富集到90（POS模式）和94条（NEG模式）代谢通路。其中，富集差异代谢物较多的为组氨酸代谢（Histidine metabolism）、源自鸟氨酸和赖氨酸及烟酸生物合成生物碱（Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine， lysine and nicotinic acid）、烟酸和烟酰胺代谢（Nicotinate and nicotinamide metabolism）、苯丙素类的生物合成（Biosynthesis of phenylpropanoids）、磷酸转移酶系统（Phosphotransferase system）、芳香族化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）等（图6）。按p值从小到大的顺序进行了排序，共找到显著性富集的KEGG路径2条，分别为源自鸟氨酸、赖氨酸和烟酸生物合成生物碱（p=0.005 9），主要包括哌啶酸（Pipecolic acid）、莨菪碱（Tropine）、野靛碱（Cytisine）、烟酸（Nicotinic acid）、L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）共5种代谢物;组氨酸代谢（p=0.019 8），主要包括咪唑丙烯酸（Urocanic acid）、L-组氨酸（L-Histidine）、L-组氨醇（L-Histidinol）、麦角硫因（Ergothioneine）、甲基咪唑乙酸（Methyl imidazole acetic acid）、1-甲基组氨酸（1-Methylhistidine）、咪唑乙酸（Imidazole acetic acid）、L-天冬氨酸（L-Aspartic acid）共8種代谢物（表1）。

3 讨论与结论

采用非靶向代谢组学技术，以不同粒径玉米芯发酵料为材料，对其中的微生物代谢产物进行检测和分析。在POS和NEG模式下分别筛选和鉴定出464种和201种差异代谢物。这些差异代谢物是影响发酵质量的主要因素[9]。差异代谢物涉及的代谢通路有芳香化合物降解、苯丙素类的生物合成、组氨酸代谢、酪氨酸代谢等。组氨酸是含有异吡唑环的氨基酸，是机体蛋白质的构成氨基酸，也是一些功能蛋白质（如血红蛋白）的主要组成氨基酸，在代谢中起重要作用[16]。酪氨酸是蛋白质代谢的标志物，在适当的条件下，某些特定的细菌能够从苯丙氨酸合成L-酪氨酸[17]。与大粒径玉米芯发酵料相比，小粒径玉米芯发酵料中酪氨酸代谢和组氨酸代谢中涉及的大部分差异代谢物含量较高，表明小粒径玉米芯发酵料中微生物酪氨酸代谢和组氨酸代谢能力较强。贾玲[18]研究发现玉米芯中纤维素、木质素和半纤维素的质量分数分别为41.87%、24.33%和36.93%。在自然界中，木质纤维素可以被微生物分解成低分子的芳香族化合物，如苯环之间用C-C键连接的联苯化合物、C-O-C键连接的芳醚、二芳基丙烷及一些单体芳香族化合物如水杨酸、阿魏酸等[19]。这些低分子化合物被运输到胞内经过一系列外围分解途径和中心代谢途径生成三羧酸循环中间体，进入三羧酸（TCA）循环，为细胞供能[19]。Actinobacteria、Thermus和Bacillus属的微生物具有降解木质纤维素和产生抑菌物质的能力，从而为后续双孢蘑菇生长创造一个适宜环境[9]。本研究结果表明，玉米芯发酵料也含有丰富的木质纤维素降解产物和抑菌物质。其中，小粒径玉米芯发酵料中木质纤维素代谢产物如原儿茶酸、水杨酸、4-氯苯酚、松柏醇等含量较高。此外，小粒径玉米芯中还有较高含量的抑菌物质如金雀花碱（Cytisine）、毛菜碱（Salsolinol）、柚皮素（Naringenin）、白藜芦醇（Resveratrol）、苯乙醛等。而大粒径玉米芯发酵料中苄星青霉素（Benzathine）含量较高，这意味着大粒径玉米芯发酵料中含有较多的青霉属杂菌，这也与实际平菇栽培中小粒径玉米芯发酵料的染菌率显著低于大粒径玉米芯发酵料的结论相一致[20]。小粒径玉米芯发酵料中吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid）含量也较高，它是一种刺激植物生长的激素类物质，对平菇菌丝生长也具有较强的促进作用[21]。Xiang等[22]研究发现，Alcaligenes、Pseudomonas属的一些细菌可以产生生长素，这可能是发酵料浸提液能够促进平菇菌丝生长的原因之一[23]。

综上所述，小粒径玉米芯发酵料质量优于大粒径玉米芯发酵料，更适宜种植平菇，该结果为发酵料栽培平菇原料的选择提供了理论依据。本研究主要是针对发酵料制备开展的代谢组学研究，而对栽培过程中不同粒径玉米芯发酵料对平菇生长发育的影响还需深入而详细的研究。

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