朱安然，杨玉洁，秦礼康，曾海英

(贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳 550025)

γ-谷维素（γ-Oryzanol）是三萜烯醇类、环木菠萝醇类阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯组成的天然混合物[1,2]，广泛存在于米糠油、玉米胚芽油、菜籽油等多种植物油中，尤其在米糠毛油中含量最高[3,4]，大约占1%～3%[5]，它的含量根据植物品种、生长环境气候和提取工艺不同而略有差异[6,7]。因其具有抗氧化[8,9]、降血脂[10]、降血糖[11]、抗炎[12]、抗糖尿病[13]、改善更年期症状[14]等生物活性，在化妆品、食品、医学行业都有着广泛的应用[15]。如今，γ-谷维素合成大多集中在化学合成法和提取技术层面[16-18]，随着γ-谷维素研究的不断深入以及人们对其认识的不断提高，不论从功能作用，还是从经济效益等角度来看，γ-谷维素新的制备方法及生产工艺都迎来了更高的挑战。

利用益生菌发酵方法提高产品品质和生理活性一直是食品行业的研究热点，然而发酵过程中存在的产物反馈抑制或自我降解的现象会在一定程度上降低目标代谢产物的累积。代谢调控是通过改变生物体中已有的代谢网络和表达调控网络从而改善细胞的性能，并用于化学转化、能量转移及大分子装配的过程[19]，增加微生物细胞膜通透性[20,21]、加入辅酶及辅因子和诱导剂类似物对酶的诱导作用等进行调控[22,23]，都能在一定程度上消除产物反馈抑制，进一步促进其积累目标产物。孙锡友[24]在发酵赤藓糖醇的研究中提到表面活性剂能影响细胞膜通透性和流动性，这样有利于细胞摄取培养基中的营养物质和胞内物质的分泌，在一定程度上有利于目标代谢产物的积累。An[25]通过研究不同诱导剂对平菇菌株发酵过程中漆酶活性的影响，得出诱导剂类型在木质素分解酶的表达中起重要作用的结论。

有研究已经表明杂粮中的γ-谷维素的含量在发酵后明显提升[26]，本研究在红曲霉发酵苦荞的基础上，从细胞膜通透性、金属离子浓度与底物诱导三个方向调控其代谢过程，以期通过代谢调控的手段能提高苦荞发酵体系中γ-谷维素的含量，为获得安全高效、产量富裕的γ-谷维素生物合成方法及苦荞资源的开发利用提供思路及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫红曲霉（Monascus purpureus），中国普通微生物菌种保藏管理中心；苦荞，贵州省威宁县东方神谷有限责任公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

主要试剂：Tween-80、Triton X-100、谷甾醇、阿魏酸、CaCl2、MgCl2、NaCl、正己烷、乙酸、乙酸乙酯，均为分析纯，γ-谷维素标品（99.9%）：美国西格玛公司。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；HH-8数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；SHP-250型智能生化培养箱，上海光都仪器设备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗机械厂；DHG-R40A型热风恒温鼓风干燥箱，上海实验仪器总厂；TCL-16B高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；KQ3200E超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；RE52CS-2旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；HN88-LⅡ 超声波细胞粉碎机，上海汉诺仪器有限公司；HZ-1102C电热恒温震荡箱，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵方法

霉菌种子液的配置参考杨玉洁[27]。

接种发酵：在250 mL三角瓶中，分别加入30 g苦荞和10 mL蒸馏水，灭菌后接入2.5 mL红曲霉菌种子液，于30 ℃的条件下静置发酵9 d。

1.3.2γ-谷维素检测

1.3.2.1 样品处理

在离心管中加入1 g发酵物和5 mL正己烷，放入温度设定为60 ℃的水浴锅中加热20 min后3000 r/min离心10 min，重复提取三次合并上清液，挥干溶液后再加入1 mL正己烷，3000 r/min离心10 min，取上清液过膜装入进样瓶。

1.3.2.2 高效液相色谱法的分析条件

色谱柱：硅胶柱（SUPELCOSILTM LC-SI，美国西格玛公司），25 cm×4.6 nm，5 μm；流动相：含有0.8%乙酸乙酯与0.8%冰乙酸的正己烷溶液；进样量：80 μL；流速：1.5 mL/min；柱温：22 ℃；检测波长：290 nm；检测器：紫外检测器。

1.3.2.3 标准曲线的建立

用正己烷配制质量浓度分别为0.20 mg/mL、0.40 mg/mL、0.80 mg/mL、1.20 mg/mL、1.60 mg/mL、2.00 mg/mLγ-谷维素标准溶液，以γ-谷维素标准溶液质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，得到γ-谷维素标准曲线线性回归方程为y=64957x+150.96，R2=0.9998，在0～2.00 mg/mL浓度范围内有良好的线性关系。

1.3.3 酶促反应

胞外全酶液：将制备好的紫红曲霉种子液直接过滤（菌浓度≥108cfu/mL），放入4 ℃冰箱中保存。

胞内全酶液：利用超声波细胞粉碎机将紫红曲霉种子液破碎并过滤（菌浓度≥108cfu/mL），放入4 ℃冰箱保存。

在两个装有苦荞基质的250 mL锥形瓶中分别加入10 mL上述两种酶液，于37 ℃条件下进行培养。在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h及48 h取出，测定γ-谷维素含量。

1.3.4 代谢调控

1.3.4.1 细胞膜通透性调节

物理方法：分别设定超声波清洗器时间为1 min、2 min、3 min、5 min和10 min，将培养24 h的苦荞发酵体系放入其中。超声处理后继续于30 ℃条件下培养至9 d。

化学方法：将Tween-80、Triton X-100及SDS 3种表面活性剂分别加入苦荞发酵基质中，添加量为2‰、3‰、4‰、5‰和6‰，用玻璃棒搅拌均匀后在30 ℃条件培养9 d。

1.3.4.2 金属离子浓度调节

将CaCl2、MgCl2及NaCl三种金属离子调节剂分别加入苦荞发酵基质中，添加量分别为2‰、3‰、4‰、5‰和6‰，用玻璃棒搅拌均匀后在30 ℃条件培养9 d。

1.3.4.3 底物诱导

将阿魏酸、谷甾醇以及阿魏酸与谷甾醇混合物（阿魏酸:谷甾醇=1:1，W:W）分别加入苦荞发酵基质中，添加量为0.2‰、0.3‰、0.4‰、0.5‰、和0.6‰。用玻璃棒搅拌均匀后在30 ℃条件培养9 d。

1.3.5 响应面实验设计

根据Design-Expert软件中Box-Behnken设计原理，在单因素研究基础上以γ-谷维素含量为响应值进行3因素3水平的试验设计及分析，以获得γ-谷维素最佳发酵工艺条件。试验因素与设计见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface analysis

1.3.6 数据处理与统计分析

以上试验每组均重复3次。使用SPSS 22.0进行统计学分析，（p＜0.05）则为差异显著，利用origin 8.0软件作图，最后采用design expert 8.06软件进行响应面实验设计及结果分析。

2 结果与讨论

2.1 紫红曲霉高产γ-谷维素发酵或转化代谢途径验证

如图1所示，经过发酵的苦荞体系γ-谷维素含量为1.58 mg/g，与其余三组相比含量增加十分显著（p＜0.05），而胞内酶组、胞外酶组与空白组γ-谷维素含量均为0.09 mg/g，表明γ-谷维素主要为紫红曲霉生长代谢中的产物，后续可以采用发酵法进行试验。发酵法使用化学试剂少、生产成本低且操作简便材料容易获得，已经被越来越多的用于工业生产，具有十分广阔的前景。

图1 不同处理方式对发酵产物中γ-谷维素含量的影响Fig.1 Effects of different treatments on the content of γoryzanol in fermentation product

2.2 基于代谢调控的高产γ-谷维素发酵体系构建

2.2.1 细胞膜通透性调节

图2 超声时间对γ-谷维素含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on γ-oryzanol content

由图2可知，随着超声时间增加γ-谷维素的含量逐渐降低。经过超声处理10 min后，苦荞发酵体系中的γ-谷维素含量由最初未超声前的1.57 mg/mL降低至0.64 mg/mL。超声处理在微生物发酵中有着广泛的应用，它可以通过增加细胞膜通透性促进细胞的生长代谢，从而达到提高发酵目标产物含量的目的。但在此次实验中超声处理反而降低了目标产物的含量，分析是因为超声处理强度过高，从而损伤了细胞致使产量明显降低。牛书操[28]合成谷胱甘肽时采用超声处理后也出现了目标产物产量降低的情况，这与本试验现象一致。

由图3可知，γ-谷维素含量先增加后下降，这可能是由于表面活性剂与生物膜中的磷脂等结合后细胞膜通透性增大，不仅使营养成分更易进入胞内，也对胞外产物量有着积极的影响，但当超过一定的浓度时，表面活性剂会对微生物有一定毒性作用，所以需要控制在适量范围内。Hu[29]等就是利用Triton X-100促进红曲色素的转移而降低了胞内反馈抑制的发生从而促进红曲色素产量的增加。在本次试验中，添加Triton X-100和SDS的苦荞基质γ-谷维素的产量在添加量为3‰时达到最大峰值，超过3‰后产量逐渐下降，添加Tween-80时最大峰值为4‰。

图3 表面活性剂添加量对γ-谷维素产量的影响Fig.3 Effect of surfactant addition on γ-oryzanol content

图4 最佳添加量下3种表面活性剂对γ-谷维素产量的影响Fig.4 Effects of three surfactants on the yield of γ-oryzanol at optimum addition

图4 为三种表面活性剂最佳添加量下γ-谷维素的产量对比。其中添加3‰ Triton X-100的苦荞发酵体系与添加其余2种表面活性剂的体系差异极显著（p＜0.01），γ-谷维素产量与未添加表面活性剂的体系相比增加了34.59%，达到2.14 mg/mL，表现出最强的促进作用。

2.2.2 金属离子浓度调节

由图5可得，添加Ca2+与Mg2+能够在一定范围内促进γ-谷维素的增加，但添加量超过4‰时γ-谷维素含量下降。Na+对γ-谷维素的合成有抑制作用，随着添加量的增加γ-谷维素含量不断降低。金属离子对红曲霉次生代谢物有着重要的调节作用，有研究已经表明丝状真菌的形态与代谢产物的形成息息相关，通过Ca2+调节菌丝分支及尖端并提高菌丝聚集可以增强真菌活力[30]。Mg2+是糖酵解酶类的辅因子，增加Mg2+浓度一定程度上能有助于糖酵解的过程进行，从而增加菌体活力而达到增加目标产物含量的目的[31]。但金属离子对次生代谢物的调节作用常存在剂量效应，不当的剂量则对次生代谢物合成产生抑制作用。而添加Na+时γ-谷维素合成受到抑制可能因为产生了盐胁迫现象损伤了细胞结构，Fonseca等的研究中就提到了盐胁迫会导致胞内各种代谢紊乱甚至细胞死亡[32]。在红曲霉发酵产多糖时，因为Na+添加量过高而使得胞外多糖产量受到较严重的抑制[33]，这也和本试验有相似之处。

图5 金属离子添加量对γ-谷维素含量的影响Fig.5 Effect of metal ion addition on γ-oryzanol content

图6 最佳添加量下金属离子对γ-谷维素产量的影响Fig.6 Effects of metal ion on the yield of γ-oryzanol at optimum addition

图6 为三种金属离子最佳添加量下γ-谷维素的产量，添加Ca2+与Mg2+的发酵体系对γ-谷维素的合成有极显著的促进作用（p＜0.01），分别达到2.04 mg/mL和1.82 mg/mL，与对照组相比，提高了29.11%和15.19%，这两者间，Ca2+的促进作用显著高于添加Mg2+的体系（p＜0.01）。

2.2.3 底物诱导

由图7可知，单独添加谷甾醇及添加阿魏酸与谷甾醇混合物，都在一定范围内对γ-谷维素的合成有促进作用，单独添加阿魏酸反而抑制了γ-谷维素的合成。γ-谷维素主要是一种三萜烯醇类为主体的阿魏酸酯和甾醇类阿魏酸酯组成的天然混合物，在路瑞秋[23]的研究中提到，加入效应物、前体物可以促进微生物目标产物的合成，有研究也已经表明紫红曲霉发酵杂粮基质时，γ-谷维素中谷甾醇阿魏酸酯的含量高于其他甾醇类阿魏酸酯[26]，因此阿魏酸谷甾醇混合物添加量为5‰时体系中γ-谷维素含量达到最大值，单独添加谷甾醇也对γ-谷维素的富集起到了正向作用。苦荞麸皮中原本含有不溶性结合态的阿魏酸，微生物发酵过程中产生的阿魏酸酯酶能够打破植物细胞壁中的致密网状结构，释放出阿魏酸等抗氧化物质[34]，添加阿魏酸后γ-谷维素合成降低可能是发生了反馈抑制，抑制了麸皮中阿魏酸的释放。

图7 底物添加量对γ-谷维素含量的影响Fig.7 Effect of substrate addition on γ-oryzanol content

图8 最佳添加量下底物种类对γ-谷维素产量的影响Fig.8 Effects of substrate on the yield of γ-oryzanol at optimum addition

图8 表明，最佳添加量下，阿魏酸对于γ-谷维素含量的累积与对照组无显著差异（p＞0.05）。单独添加谷甾醇时γ-谷维素的含量达到1.87 mg/mL。而添加阿魏酸与谷甾醇混合物时，苦荞发酵体系中γ-谷维素产量达到2.25 mg/mL，与未添加组相较增加了42.41%，与单独添加阿魏酸或单独添加谷甾醇试验组差异显著（p＜0.05）。

2.3 响应面优化调控参数

图9 各因素交互作用响应曲面及等高线图Fig.9 Response surfaces and contour of the interaction of various factors

依据Design-Expert软件中的Box-Behnken设计原理，在单因素实验的基础上，以γ-谷维素含量为考察指标，设计3因素3水平优化实验，结果见表2。

通过Design-Expert软件对试验数据进行多元回归方程拟合，得到Triton X-100添加量（A）、Ca2+添加量（B）和底物添加量（C）的二次多项回归模型为：Y=2.59+0.088A-0.079B-0.11C+0.018AB+0.046AC-0.0 23BC-0.22A2-0.047B2-0.33C2。由表3方差分析可得，模型高度显著（p＜0.01），失拟项不显著（p＞0.05）。R2=0.9906，RAdj2=0.9786表明该模型回归效果达到理想水平，预测值与真实值有较好拟合性。一次项中Triton X-100添加量（A）、Ca2+添加量（B）和底物添加量（C）均对γ-谷维素含量影响极显著（p＜0.01），二次项中A2与C2差异极显著（p＜0.01），B2差异显著（p＜0.05），交叉项只有AC影响显著（p＜0.05）。由F值大小可知:底物添加量（C）＞Triton X-100添加量（A）＞Ca2+添加量（B）。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由图9可知，AC交互作用响应曲面曲线走势最为陡峭，等高线呈密集椭圆形，而其他因素相比之下次之，说明Triton X-100添加量与底物添加量间的交互影响对γ-谷维素含量有显著影响，而Triton X-100添加量与Ca2+添加量的交互作用及Ca2+添加量与底物添加量的交互作用，对γ-谷维素含量影响较小，与方差分析结果一致。

根据方程拟合结果，预测得出最佳累积γ-谷维素含量最佳工艺条件为：Triton X-100添加量3.2‰，Ca2+添加量4.2‰，阿魏酸与谷甾醇混合底物（阿魏酸:谷甾醇=1:1，W:W）添加量0.5‰，按照此条件进行验证试验，得到对应γ-谷维素含量为2.61 mg/mL，与预测结果2.63 mg/mL无显著性差异（p＞0.05），表明响应面法确定的优化结果正确可靠。

3 结论

实验在紫红曲霉发酵苦荞的基础上，通过加入金属离子、表面活性剂和底物诱导来调控发酵过程中的微生物代谢。结果表明γ-谷维素主要为紫红曲霉生长代谢中的产物，发酵法能显著促进γ-谷维素的积累。超声处理对γ-谷维素的合成有抑制作用，Ca2+、Mg2+和表面活性剂均对目标产物的富集有正向调节的作用，当添加0.5‰的阿魏酸与谷甾醇1:1混合物时，结果比对照组增加了42.41%，达到2.25 mg/mL。最后，在单因素分析基础上，使用Box-Behnken设计3因素3水平试验得到发酵工艺为：Triton X-100添加量3‰、Ca2+添加量4‰及阿魏酸与谷甾醇1:1混合物添加量0.5‰。通过验证实验，得到γ-谷维素含量达2.61 mg/mL，与未发酵前相比提高了31.62倍、与未调控前相比提高了1.64倍，证明该工艺极大促进发酵产物中γ-谷维素的累积，为贵州特色杂粮品质提升、功能活性成分富集研究提供新的思路及技术参数。