王伟英，邹 晖，戴艺民，林江波

（福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意义】铁皮石斛（Dendrobium officinale）富含多种营养功效成分，其中铁皮石斛的多糖含量丰富且多为功能性多糖，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力等生理功能[1−3]。而石斛倍半萜类生物碱是石斛属植物特有的石斛碱，石斛碱与非甾体类抗炎药药理作用相似，具有免疫调节、抗炎、扩张血管等作用[4−5]；氨基酸与药效也存在着密切关系，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸是发挥临床与保健功效的重要成分[6−7]，对人体也有良好的保健作用。因此，铁皮石斛的多糖和石斛碱等营养成分在药用和保健上都有很大的应用价值。同时铁皮石斛是一种典型的内生菌根植物，菌根真菌参与整个生长发育过程，对种子萌发、植株营养生长、生殖繁育具有促进作用[8−10]。内生真菌在铁皮石斛的人工栽培、引种驯化以及资源再生和保护等方面也具有重要的应用价值和前景。【前人研究进展】内生真菌在石斛的生长发育中起着促进生长的作用，主要表现为提高鲜重、干重、株高、茎长、茎粗、茎节数、节间长、分蘖株数以及新根数等[11−12]，也可增加B、Si、Fe、Cu和Mn等营养元素的含量[13]，还可促进多糖、石斛碱以及氨基酸含量等主要营养成分的积累[14−15]。【本研究切入点】目前有关瘤菌根菌与铁皮石斛互作的研究主要以组培苗为研究材料[16]，而对室外的土栽盆苗的研究还较少，室外的土栽盆苗的种植条件与大棚种植更为接近，因此对铁皮石斛的种植更具有指导意义。【拟解决的关键问题】本课题组在前期已分离出瘤菌根菌[17]，并通过与铁皮石斛根共培养后建立共生关系形成菌根且能定殖于根中，诱导根系结构发生改变生成侧根，同时也促进铁皮石斛植株的生长[18]。因此本研究将在瘤菌根菌与铁皮石斛形成互作关系的基础上研究铁皮石斛地上部的农艺性状及其不同生长年限鲜条的营养成分的变化，为内生真菌在铁皮石斛的人工栽培应用奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为冠豸山野生铁皮石斛，瘤菌根菌菌种标本保藏于福建省农业科学院亚热带农业研究所。

1.2 仪器

Thermo U-3000液相色谱仪（美国Thermo公司）；L5S型紫外见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；L-8800型氨基酸自动分析仪（日本日立高新技术公司）；UPW-20N型超纯水机（北京历元电子仪器有限公司）；BS110S型分析天平（德国Sartorius集团）；101A型恒温鼓风干燥箱（上海市实验仪器总厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 石斛盆栽苗的准备 泥炭土高温灭菌后装入未使用过的花盆，在3月份将铁皮石斛组培苗种在花盆中，每个处理12盆，每盆种3丛，每丛3株石斛苗。

1.3.2 菌液培育与接菌处理 配制液体PDA培养液，接入瘤菌根菌，放入摇床，180 r·min−1，28 ℃，震荡培育7 d后用粉碎机搅碎大块菌丝至均匀，设置接菌的为处理组（T），用5 mL移液枪将菌液接种在石斛的根基部，每丛分3点各接5 mL，接12盆。未接菌的为对照组（CK），用5 mL移液枪将无菌培养液接种在石斛的根基部，每丛分3点各接5 mL，接12盆。种后当年的3～6月份每月接菌1次，接菌4次，当年封顶的鲜条保留在盆里，次年铁皮石斛长出芽，新芽苗生长至封顶后的鲜条为1年条，而前一年的鲜条为2年条。在花芽分化时分别剪取1年条和2年条，并分别测定每根鲜条的长度、茎粗、有效茎数、茎重等。

1.3.3 指标测定 水分的测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[19]；粗蛋白含量的测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[20]；灰分的测定参考GB5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[21]；粗纤维的测定参考GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维的测定》[22]；氨基酸的测定参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[23]；粗多糖的测定参考SN/T 4260—2015《出口植物源食品粗多糖的测定》[24]；石斛碱测定参考申刚等HPLC法[25]；长度大于5 cm的铁皮石斛茎秆为有效茎秆，统计每盆中的有效茎秆数，取平均值即为每盆的有效茎数；称量每根的有效茎秆重量，取平均值即为平均单茎重。

1.4 数据处理

所有数据使用SPSS 19.0统计软件，采用Studenttest分析方法进行检验处理间差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 瘤菌根菌对不同生长年限铁皮石斛农艺性状的影响

当石斛盆栽苗经过接菌共培养后，发现接菌处理的铁皮石斛盆栽苗长出的新芽苗比对照的新苗多，且新苗生长旺盛，茎粗壮，叶片颜色浓绿, 而对照的新苗叶色绿中带黄，生长较慢（图1-A）。同时还发现接菌后1年生和2年生的铁皮石斛的有效茎条都多于对照，且鲜条长度明显长于对照（图1-B、C）。这表明浇灌瘤菌根菌能促进铁皮石斛新芽的萌发和生长，明显提高了铁皮石斛的有效茎数。

图 1 瘤菌根菌对不同生长年限铁皮石斛的农艺性状的影响Fig. 1 Effect of Epulorhiza symbiosis on agronomic characteristics of one- and 2-year-old D. officinale plantlets

2.2 瘤菌根菌对不同生长年限的铁皮石斛含水量、茎长、有效茎数、茎径、茎重的影响

石斛产量与有效茎数和单茎重量密切关联，在单位面积内既要足够的有效茎数和茎长，且植株粗壮，才能提高产量。从表1可以看出，接菌培养后1年条和2年条的有效茎秆数都多于未接菌的对照，分别增加了65.67%和74.25%，差异显著。茎长是衡量石斛产量的主要指标，试验发现接菌后的1年条和2年条的茎长也都长于对照，增幅分别为43.51%和47.85%，差异显著。接菌后的1年条和1年条的茎径宽度也都宽于对照，宽度分别增加了34.21%和60.71%，差异显著。接菌后的1年条和2年条的平均单茎重高于对照，增幅分为别55.29%和51.45%，差异显著。茎重与茎长、茎径成正比关联，其中茎重与茎径的相关系数r为0.95，显著正相关；茎重与茎长的相关系数r为0.84，具有很强的线性正相关。因此从接菌后的铁皮石斛的单茎重、茎长和有效茎数都高于对照的结果可以得出接菌后的铁皮石斛产量也高于对照。

表 1 瘤菌根菌对不同年限铁皮石斛的茎长、有效茎数、茎径、茎重的影响Table 1 Effect of Epulorhiza symbiosis on length, viable stem count, diameter, and weight of one- and 2-year-old D. officinale stems

2.3 瘤菌根菌对不同年限铁皮石斛的主要营养成分的影响

不同年限铁皮石斛的主要营养成分见表2。接菌后的铁皮石斛鲜条的含水量、粗蛋白都高于相同年限的对照，说明了接菌后加快铁皮石斛的生长，也加快铁皮石斛的代谢和提高合成物质的能力，提供较多生长所需的物质。而接菌后的粗纤维、灰分含量低于未接菌的对照，差异显著，远低于2015版《中国药典》总灰分含量不得高于占干重5.0%的限量要求[26]。表2中还可以得出，2年条的多糖含量高于1年条的多糖含量，且差异显著，其中接菌与未接菌的2年条多糖含量较高没有显著差异，但接菌与未接菌的1年条的多糖含量差异显著，接菌后比未接菌的对照增加了30.39%，这说明接菌后既能促进铁皮石斛植株的生长，也不影响多糖的积累。石斛碱是石斛的特征性物质，检测结果可知，石斛碱在所测定的指标中含量最低，含量占鲜重的0.03%左右，符合2015版《中国药典》石斛碱含量不得少于占干重的0.40%的限量要求[26]。

表 2 瘤菌根菌对不同年限铁皮石斛的主要营养成分的影响Table 2 Effect of Epulorhiza symbiosis on major nutritional constituents in one- and 2-year-old D. officinale（单位：%）

2.4 瘤菌根菌对不同年限铁皮石斛的氨基酸组成的影响

氨基酸是一切生命之元，植物在光合作用中在各种酶与酶系统的参与下可经生物化学作用合成氨基酸，对植物本身而言氨基酸能够促进根系生长、壮苗、健株、增强叶片的光合功能及抗病虫害能力，达到增产效果；对人体而言植物氨基酸能提供人体不能自己制造的必需氨基酸，对生命活动发挥着举足轻重的作用。不同年限不同处理的4种铁皮石斛氨基酸的测定结果见表3。由表3可知，试验中的4种铁皮石斛的氨基酸种类齐全，都检出了17种氨基酸。检测发现，相同年限的接菌处理后的铁皮石斛条的氨基酸总量和必需氨基酸都高于对照，差异显著；接菌后的1年条的氨基酸总量与未接菌的2年条的氨基酸总量相近，而必需氨基酸含量却超过了未接菌的2年条的必需氨基酸含量。从必需氨基酸与非必需氨基酸（EAA/NEAA）的比值来看，1年条的EAA/NEAA的比值为0.61，已达到FAO/WHO的理想模式（0.60）。由此可见，接菌后的铁皮石斛尽管产量提高，但氨基酸的含量和EAA/NEAA的比值都高于未接菌的对照，表明接菌后的铁皮石斛的氨基酸营养价值高于未接菌的铁皮石斛，接菌后1年条的氨基酸营养价值可达到未接菌的2年条的氨基酸营养价值水平。从氨基酸组成看，1年条、2年条铁皮石斛中氨基酸的种类和含量的高低顺序基本一致，含量最高的是天冬氨酸，其次是谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸。其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鲜味的特征氨基酸，两者均占总氨基酸含量的30%以上，具有调节口感的作用。

3 讨论与结论

近年来，很多药用植物野生资源不合理的过度开发利用，造成了资源面临枯竭，人工种植成为一条必然之路。但在人工种植中往往会出现生物产量和经济产量的提高与有效成分的含量下降的矛盾[27]。因此，既要保证较高的有效成分，又要有较高的产量也成了人工种植铁皮石斛的主要难题。但产量与质量不是对抗性矛盾，如果采取特殊的栽培措施，如加强田间管理，及时施肥，促进植株健壮生长，是可以达到产量高有效成分也相对较高的效果。

药用植物的产量是指单位土地面积上药用植物群体的产量，即由个体产量和个体数量构成。铁皮石斛产量与在单位面积内的有效茎数和单茎重量密切关联，既要足够的有效茎数和茎长，且植株粗壮，才能提高产量。目前已发现多种能促进铁皮石斛生长提高产量的内生真菌，本试验中的瘤菌根菌与铁皮石斛盆栽苗共培养后，可以促进植株生长，增加有效茎秆和茎秆长度，提高了产量。这一结果与其他研究者的结果一致，其中金辉等[13]分离出的瘤菌根菌与组培苗共同培养60 d后，接菌组培苗平均鲜重增长率比对照苗高出了84.8%，俞婕等[28]发现菌株ZJSH1对铁皮石斛植株苗有显著的促生作用，董金海等[29]发现菌株NL-215对铁皮石斛试管苗的鲜重、株高、叶绿素和糖等各项表观及内含物指标上都有明显的促进作用。菌根真菌的促生作用的原因可能是菌根真菌与根系共培养后形成和建立了互惠共生关系诱导产生植物激素，促进了根系侧根和根毛的生成，进而形成了发达的地下部系统，能更好地吸收营养物质来供地上部茎和叶的生长[18]，促进了植株高度、叶片数和叶宽的增加[17]。其中根系所吸取的营养物质一部分来自菌丝圈和菌丝结逐渐降解形成的菌体的营养物质，为植物提供维生素B1、维生素的前体PABA氨基酸、生长调节剂和生长所需的多种微量元素[30]；另外一部分营养物质来自根系周围的培养基成分或者土壤储存的水分、空气和矿质元素。

表 3 瘤菌根菌对不同年限铁皮石斛的氨基酸组成的影响Table 3 Effect of Epulorhiza symbiosis on amino acid composition of one- and 2-year-old D. officinale

菌根真菌不仅能促进生长提高产量，还能提高多糖、蛋白质、氨基酸及生物碱等代谢成分的积累[31]。王秋霞等[12]通过15N稳定同位素标记发现瘤菌根菌和胶膜菌能显著促进金钗石斛对有机氮的利用和石斛碱的积累；朱波等[16]研究结果：通过接种铁皮石斛内生真菌可以提高多糖含量，促进甘露糖和醇溶性浸出物积累。本试验发现接菌后1年条的多糖含量显著提高，增幅达到30.39%；接菌后的1年条的氨基酸总量与未接菌的2年条的氨基酸总量相近，而必需氨基酸含量却超过了未接菌的2年条的必需氨基酸含量。试验结果与龚记熠[14]等研究结果相似，其认为内生真菌能减少金钗石斛幼苗叶绿素SPAD值的降低，保证光合作用有序进行，促进有机物的合成，增加干物质量；帅红艳[30]认为瘤菌根菌一定程度上影响了调控系统，使得物质代谢、光合作用等增强，促进初级代谢产物（多糖、氨基酸）和次生代谢产物（生物碱）的合成和积累。

另外，影响有效成分的积累与生长年限和采收时间有关，唐丽等[32]认为总多糖主要集中于茎，以2年龄茎的含量最高，且随着生长龄的增加而逐渐减少。而总生物碱主要集中于叶片，以1年龄叶的含量最高。吴经耀[33]研究得出铁皮石斛头年10月到翌年3月多糖含量最高，为最佳采收期。封顶后的石斛叶片会慢慢衰老脱落，在叶片脱落前其所含的营养物质一部分以氨基酸的形式转移进茎干，此时茎干的氨基酸含量较高。因此适时采收也是提高药用植物质量的至关重要的因素，在封顶之后开花之前是铁皮石斛的最适采收期，所以在每年的3月采收更科学合理，此时口感和风味最好。这是由于铁皮石斛鲜条每年在11～12月份封顶而停止生长，3～5月份为新芽和花芽分化，会消耗其积累的营养物质，且粗纤维的含量增加，影响咀嚼口感和风味。而当粗纤维较高时会降低养分的消化率以及肠道对一些小分子养分物质的吸收。

从当前的林下种植、仿野生种植来看，铁皮石斛的有机种植将会是一种主要的种植模式，而铁皮石斛内生真菌的开发和应用是解决铁皮石斛有机种植产量问题的重要措施。本试验中铁皮石斛与瘤菌根菌建立共生关系后根系发达且根系活力增强，能吸收较多的营养物质供地上部生长，茎秆饱满，茎皮薄，粗纤维少，粘汁多；叶数增多，叶面积增大且叶色浓绿，合成代谢物的能力增强，积累更多的多糖、蛋白质、氨基酸及生物碱，即提高了产量也提高了有效成分的含量，其中接菌后的1年条茎秆的营养价值与正常条件生长的2年条茎秆营养价值相近。因此，本试验所用的瘤菌根菌在石斛的生产和种植上具有较大的应用前景，为实现高产优质的目的提供一条重要的途径。