李秋菊，孙明梅 ，费景春，潘志忠，魏 星

（1.松原职业技术学院，吉林 松原 138000；2.辽源市动物疫病预防控制中心，吉林 辽源 136220）

猪圆环病毒 2型 （Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染是一种以断乳猪进行性消瘦、呼吸困难、腹泻及明显的淋巴组织病变为主要特征的疾病［1-3］。研究表明，PCV2感染除了造成PMWS外，同时还与猪呼吸道综合症、猪皮炎和繁殖障碍等密切相关［4-5］。PCV2经常与猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)或猪细小病毒(PPV)并发感染或继发细菌感染,使患病猪病情加重,导致基因缺失突变[6]。所以，通过当地流行毒株进行PCV2的分离鉴定，筛选免疫原性较强的毒株用于制备PCV2灭活疫苗，对PCV2防控具有十分重要的意义。

1 试验材料

1.1 病料来源

从松原地区某发病猪场采集疑似猪圆环病毒感染病猪的腹股沟淋巴结，共12份。

1.2 试验材料

PK15细胞，PCV检测为阴性，由本公司研究室保存；基因组提取试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒小提试剂和索莱宝公司Ex Taq DNA Ploymerase工具酶，购自TaKaRa公司；MEM培养基和胎牛血清，均购自Invitrogen公司。

2 试验方法

2.1 病料处理

取疑似猪圆环2型病变肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结，加入5 mL MEM(含青霉素最终浓度为100U/mL、链霉素100U/mL)生长液研磨。加入3 mL氯仿，充分混匀，12000 rpm/min离心20 min。吸取上清液用0.22 um过滤除菌。将病毒悬液1 mL接种于长成单层的PK-15细胞，37℃ 5% CO2感作50 min，补充2% MEM营养液继续培养24 h。弃上清液，用终浓度为0.3的M D-氨基葡萄糖37℃处理30 min。弃掉0.3的M D-氨基葡萄糖液，用MEM洗涤2次，用2%胎牛血清与双抗的MEM继续培养2～3 d，收集细胞毒液。

2.2 PCR鉴定与分型鉴定

根据已发表的PCV2序列设计PCV ORF2引物：ORF2F:5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'，ORF2R:5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-5'，产物长度为702 bp；同时，设计另一对引物克隆其余部分基因片 段，FragLF：5'-GAATTCCTGCGGGGGCG GTGTCTTCT-3'；……