张立国,艾冰凌,李建政,班巧英*

氧化还原介体强化厌氧活性污泥发酵产氢特征

张立国1,2,艾冰凌3,李建政4,班巧英1,2*

(1.山西大学环境与资源学院,山西 太原 030006；2.山西省黄河实验室,山西 太原 030006；3.中国热带农业科学院海口实验站,海南 海口 571101；4.哈尔滨工业大学环境学院,黑龙江 哈尔滨 150090)

为提高厌氧污泥的发酵产氢能力,采用间歇培养方式考察了氧化还原介体(ROMs)对厌氧污泥发酵葡萄糖产氢效能的影响,并通过Illumina MiSeq测序揭示了ROMs对微生物群落的影响.结果表明,在发酵液体积为100mL及葡萄糖初始浓度500mg/L条件下,对照的累计产氢量和最大产氢速率(max)分别为11.0mL和0.28mL/h.当腐殖酸和蒽醌-2-磺酸钠(AQS)作为ROMs加入发酵体系后,厌氧污泥的产氢能力显著提高,其累计产氢量和max分别比对照高出56.4%、13.6%和 53.6%、10.7%.相反,氧化石墨烯(GO)、指甲花醌和蒽醌-2,6-二磺酸钠(AQDS)导致厌氧污泥的产氢能力受到不同程度的抑制.Illumina MiSeq测序揭示了发酵系统的优势菌群存在显著差异.对照系统中的优势菌群主要来自5个属(、、、、),腐殖酸、AQS和指甲花醌发酵系统的主要优势菌群为、、,而、、、为AQDS和GO发酵系统的主要菌群.冗余分析的结果表明,产氢量与和呈正相关,而与和呈负相关.

厌氧活性污泥；氧化还原介体；发酵产氢；微生物群落

随着化石能源的日益减少,可再生能源的开发与应用迫在眉睫.氢气因其具有热值高、无污染、可再生等优点而成为一种理想的替代燃料.与物理、化学方法相比,生物制氢可以利用各种有机废水、固体废弃物为原料产氢,因此受到研究者的广泛关注[1-2].目前,厌氧细菌暗发酵制氢是研究较多的生物制氢方法之一,该法能够利用廉价的有机废弃物为原料进行低成本制氢,但产氢效率有待提高[3-4].因此,强化厌氧细菌暗发酵产氢效能对于提高有机废弃物生物制氢效能具有重要意义.

氧化还原介体(ROMs)可以加速氧化还原反应过程中的电子传递速度,使反应速率提高1个到几个数量级[5].近年来,ROMs被广泛用于强化污染物的去除[5-7].有机物厌氧发酵产氢是通过一系列氧化还原反应实现的.可见,ROMs的生物催化功能有望提高厌氧污泥的产氢能力,进而改善有机物暗发酵产氢效能.因此,本研究通过间歇试验考察了蒽醌-2,6-二磺酸钠(AQDS)、蒽醌-2-磺酸钠(AQS)、指甲花醌、氧化石墨烯(GO)、腐殖酸对厌氧污泥发酵葡萄糖产氢的强化效果,并通过高通量测序揭示了ROMs对产酸发酵相关微生物菌群的影响,为ROMs强化有机物厌氧发酵制氢提供新的技术参考.

1 材料与方法

1.1 接种污泥和试验废水

接种污泥取自太原市某城市污水处理厂的缺氧池,将污泥混合液置于烧杯中静置6h,弃上清后用于试验. 污泥浓度为2.4g MLVSS/L.本研究中所用有机废水为人工合成废水,以5000mg/L葡萄糖作为唯一碳源,并添加微生物生长繁殖所需要的其他营养元素[8].

1.2 ROMs固定化

选AQDS、AQS、指甲花醌、GO、腐殖酸,作为强化葡萄糖厌氧生物制氢的ROMs.其中,AQDS、AQS和指甲花醌采用海藻酸钙包埋法进行固定[8].

1.3 ROMs强化有机废水厌氧发酵产氢试验

试验采用间歇培养方式进行,实验容器为300mL厌氧瓶.每个厌氧瓶中加入10mL接种污泥和10mL试验废水,然后向厌氧瓶中加入一定量空白海藻酸钙珠子(对照),AQDS、AQS、指甲花醌海藻酸钙珠子,GO和腐殖酸,使ROMs的终浓度均为80mg/L,加入适量蒸馏水使液相总体积达到100mL.用1mol/L HCl调培养液pH值至6.5.连续通入5min N2后立即密封.随后用注射器向厌氧瓶中加入0.02%氯仿抑制产甲烷菌的活性. 将所有厌氧瓶置于35℃、120r/min条件下恒温震荡培养.每组试验设置3个平行样,数据分析取其平均值.每12h测定气体组成,并于发酵结束时测定挥发酸(VFAs)浓度.

1.4 Illumina MiSeq测序

称取0.15g污泥(湿重),采用DNA提取试剂盒(E.Z.N.ATMMag-BindSoilDNAKit,,Inc., USA)提取污泥总DNA.以样品DNA为模板,用通用引物27F,5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′, 515R,5′-CACGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC- 3′对细菌的16S rRNA基因V1～V3区进行PCR扩增.构建Illumina平台文库并测序. Illumina MiSeq测序原始序列提交NCBI,登录号为PRJNA670924.使用Mothur软件(version v.1.30.1)对测序获得的原始序列进行质控筛选和过滤,按照97%相似性进行操作分类单元(OTU)聚类分析,在聚类过程中去除嵌合体,得到各OTU的代表序列,在Silva数据库(http://www.arb-silva.de)进行比对、物种注释,最后在门水平和属水平进行群落结构分析.冗余分析采用软件Canoco 5.0进行.

1.5 分析项目及方法

生物量(挥发性悬浮固体总量MLVSS)采用标准方法测定[9],产气量通过10～50mL的玻璃注射器排气计量.发酵气体的组分和挥发酸浓度分别采用山东滕州瑞普分析仪器有限公司的RP-6800A型(TCD检测器)和RP-6890型(FID检测器)气相色谱测定.累计氢气产量参照Owen法进行计算[10].

1.6 动力学分析

不同ROMs作用下的产氢动力学分析参照Gompertz模型(式1).

式中:为反应(h)累计氢气产量,mL;max为最大产氢量,mL;max为最大产氢速率,mL/h;为延迟时间,h; e为常数.

将累计甲烷产量和相应反应时间代入式(1),用统计软件Origin 9.0计算出max、max、λ[10].

2 结果与讨论

2.1 累计氢气产量

ROMs可以提高电子从初级电子供体传递到最终电子受体的速度,从而提高氧化还原反应速率[5].在已有文献中,醌类物质和腐殖质是研究较多的ROMs[5].因此,本研究考察了AQDS、AQS、指甲花醌、GO和腐殖酸对厌氧活性污泥发酵产氢的影响.如图1所示,在培养12h后,对照的累计产氢量为2.7mL,随着培养时间延长,累计产氢量逐渐提高,经过84h连续培养后,达到平台期,累计产氢量为11.0mL.当加入ROMs后,厌氧污泥发酵产氢能力受到不同程度的影响.其中,腐殖酸和AQS可提高厌氧污泥发酵产氢的效能.腐殖酸试验组在培养初期就表现出较高的活性,培养12h后的累计氢气产量达到了4.0mL,比同期对照组高出48.1%,随着培养时间延长,累积氢气产量逐渐增加,最终在72h达到稳定,为17.2mL,比对照高出56.4%.研究表明,腐殖酸的电子传递能力主要依赖醌、酚等官能团的存在[11].尽管AQS也能提高厌氧活性污泥的产氢能力,但其强化效果低于腐殖酸.当AQS作为ROMs时,培养前期表现出与对照相似的产氢活性,但在培养24h后,AQS试验组的产氢能力高于对照,并在84h达到最大值,比对照高出13.6%.腐殖酸和AQS能强化厌氧污泥发酵产氢效能主要是由于它们能够降低葡萄糖氧化还原反应的活化能、提高产氢微生物的能量利用效率[5].然而,当GO、指甲花醌和AQDS作为ROMs时,厌氧活性污泥的产氢能力却受到不同程度的抑制.在接种初期,它们的发酵产氢速率就低于对照,随着培养时间延长,累积产氢量逐渐增加并最终分别稳定在5.6,2.1和10.1mL.除此之外,从图1可知,指甲花醌试验组存在明显的耗氢现象,可能是由于指甲花醌的加入促进了一些耗氢菌的生长.

图1 不同ROMs条件下累积产氢量

2.2 动力学分析

为了解各发酵系统的动力学特征,采用改进的Gompertz模型(式(1))对累计氢气产量曲线进行了非线性拟合(表1).如表1所示,除指甲花醌发酵系统外,其余发酵系统的拟合系数(2)均大于0.99,表明该模型用来描述累计产氢量的进程是合理的.在对照组中,λ为3.19h,当系统中加入AQS和腐殖酸后,λ分别比对照缩短了11.3%和31.3%.与之相反,加入AQDS和GO之后,明显延长,分别为3.65 和3.75h.由表1的拟合结果可以发现,腐殖酸发酵系统中的最大产氢速率(max)和最大氢气产量(max)分别为0.43mL/h和17.1mL,显著高于对照组,分别比对照提高了53.6%和58.3%.其次,AQS发酵系统的max和max也高于对照组,分别比对照高出10.7%和14.8%.然而,GO发酵系统的max和max却显著低于对照组.尽管AQDS发酵系统的max与对照相似,但max却比对照减少了42.9%.产氢动力学的结果表明,腐殖酸可以显著强化厌氧活性污泥的产氢能力,而AQDS和GO却抑制了产氢菌的活性.

表1 不同ROMs条件下产氢动力学分析

注:“-”表示该系统不符合Gompertz模型.

2.3 液相末端产物

有机物厌氧发酵产氢过程通常伴随着挥发酸的产生[12].如图2所示,对照组中的液相末端产物以乙醇、乙酸和丙酸为主,含量分别为71.2,174.4和92.6mg/L.而丁酸含量显著低于其他挥发酸,仅占挥发酸总量的6.1%.类似地,当AQDS、GO和指甲花醌作为ROMs时,乙醇、乙酸和丙酸仍然为主要液相末端产物,浓度分别为33.7～67.3,89.8～184.4和82.7～ 134.3mg/L.然而,当AQS和腐殖酸作为ROMs时,丁酸浓度显著高于其他发酵系统,分别为129.5和83.6mg/L,成为主要液相末端产物之一.此外,AQS和腐殖酸发酵系统的挥发酸总量也高于其他发酵系统,表明AQS和腐殖酸能够提高产酸发酵菌群的活性.相反,GO和指甲花醌发酵系统的挥发酸总量比分别对照低10.0%和24.9%,表明GO和指甲花醌不仅抑制了产氢菌的活性(图1),同时对其他发酵菌也有一定的抑制作用.

图2 ROMs对发酵液相末端产物的影响

结合图1和图2可以发现,AQS和腐殖酸的加入能够在一定程度上提高产丁酸菌的活性,从而提高氢气产量.另外,腐殖酸发酵系统中丙酸含量仅为49.6mg/L,有利于后续降解的进行.

2.4 微生物群落结构

2.4.1 多样性和丰富度 厌氧活性污泥的产氢效能与其群落结构密切相关[13].本研究采用Illumina MiSeq测序技术对不同发酵系统中厌氧污泥进行了群落结构解析.如表2所示,6个样品包含的有效序列数目为30599～31860.基于97%相似性对序列进行OTUs聚类分析,在对照、AQS、腐殖酸、AQDS、GO和指甲花醌污泥样品中分别获得3423,3574, 3766,3644,3638和3099个OTUs.多样性指数(Shannon和Simpson)表明,6个污泥样品中微生物具有相似的多样性,而对照和AQS组的丰富度指数(Chao1和Ace)低于其他发酵系统. 尽管Chao1和Ace估计的OTUs数目高于实际检测值,然而文库覆盖率(Coverage)达到了93%以上,表明样品中主要微生物已被检测到.

表2 不同ROMs条件下微生物群落多样性和丰富度分析

2.4.2 微生物群落结构相似性 为揭示不同ROMs发酵系统中微生物群落结构的差异性,对所有样品进行主坐标分析(PCoA),并通过Venn图揭示了OTUs分布特征.如图3(a)所示,PCoA1和PCoA2的贡献率分别为54.0%和24.0%. PCoA分析结果表明,对照和GO及AQDS和AQS发酵系统中主要微生物相似性较高,而指甲花醌和腐殖酸发酵系统中的主要微生物与其他样品差异较大. Venn图进一步揭示了6个样品中共有和独有的OTUs数目.由图3(b)可知,790个OTUs存在于所有样品中.而对照、AQS、腐殖酸、AQDS、GO和指甲花醌样品中独有的OTUs数目分别为819,938, 1042,1023,980和1017.

2.4.3 主要微生物种群的相对丰度 如图4(a)所示,6个样品中OTUs所代表的序列在系统发育上涉及8个门,即:变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和绿菌门(Ignavibacteriae).其中,变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门为中温厌氧反应器中常见的水解发酵菌群[14].与已有研究结果相似,本研究发现变形菌门和绿弯菌门为所有样品的优势细菌门.在对照和AQDS中,变形菌门的相对丰度分别为33.3%和33.5%,而AQS、腐殖酸、GO和指甲花醌的加入刺激了变形菌门微生物的生长,使其相对丰度比对照高出6.3%～19.2%.相反,绿弯菌门的相对丰度在对照、AQDS和GO中较高,而在AQS、腐殖酸和指甲花醌中的相对丰度较低.另外,在对照中浮霉菌门的相对丰度为11.5%,ROMs的加入抑制了它们的生长,而ROMs(GO除外)使厚壁菌门的相对丰度比对照显著提高了0.3～2.2倍.其余细菌门的相对丰度在各样品之间没有显著差异.从图4b可以看出,在属水平上未分类和其他序列的相对丰度高达45.5%～52.4%和20.4%～30.4%.由此可见,这些未知功能的微生物种属在葡萄糖发酵产氢过程中起着重要作用.此外,高通量测序共检测到11个主要菌属.在对照组中,(10.9%)、长绳菌属(2.8%)、(2.2%)、(2.6%)、动性杆菌属(2.2%)为主要菌群,它们能够利用一些碳水化合物、酵母粉、蛋白胨等进行生长繁殖[15-18].当加入ROMs后,、和的生长受到不同程度的抑制,其相对丰度较对照降低了15.9%～56.0%.相反,ROMs促进了的生长繁殖,腐殖酸使得的相对丰度比对照高出1.7倍.除了以上主要菌群外,在对照组中还存在少量其他菌群.可以小分子有机酸(如延胡索酸、乳酸)为碳源,其相对丰度为1.7%,加入ROMs后,其数量显著增加[19].(产酸发酵菌)、磂黄果菌属(紫色硫细菌)和小梨形菌属(专性好氧菌)在6个样品中的相对丰度相似,为0～1.4%之间[20-21].另外,由图4b可知,产酸发酵菌屠场杆状菌属和束毛球菌属只存在于部分样品中.在AQS、腐殖酸和AQDS样品中的相对分度分别为0.7%、1.0%和0.7%,而(1.1%)仅存在于腐殖酸样品中.

图4 不同ROMs条件下细菌群落的相对丰度

2.5 优势功能菌群与产氢效能的关系

为了解发酵系统中优势微生物种群与厌氧污泥产氢效能之间的关系,对优势微生物和产量、VFAs进行冗余分析(RDA)(图5).结果表明,产氢量与、、、和呈正相关,且这些菌群在腐殖酸发酵系统中的相对含量较高,使得腐殖酸系统的累计氢气产量最大(图1).从图5还可以看出,产气量与、、和呈负相关,它们主要分布在指甲花醌系统中,导致指甲花醌系统的累计产氢量仅为2.1mL,且存在明显的耗氢现象.另外,RDA结果显示,氢气产量与丁酸、乙醇含量正相关,而与丙酸呈负相关,表明丁酸型、乙醇型发酵有利于氢气产生,而丙酸型发酵不利于氢气产生,这与以前研究结果一致[22].

图5 优势菌群、产氢量和VFAs之间的冗余分析

3 结论

3.1 腐殖酸能够显著提高厌氧污泥的产氢能力,其累计氢气产量达到了17.2mL,比对照高出56.4%,且max比对照提高了53.6%;然而,AQDS、GO和指甲花醌对厌氧污泥发酵产氢有一定的抑制性.

3.2 对照、AQDS、GO和指甲花醌发酵系统的液相末端产物以乙醇、乙酸和丙酸为主,而在AQS和腐殖酸系统中,丁酸也成为主要液相末端产物之一,且挥发酸总量显著高于其他组.

3.3 腐殖酸使优势菌群从、、、和演替为、和,冗余分析表明产氢量与、、、和呈正相关.

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Improving fermentative hydrogen production of anaerobic sludge by redox mediators.

ZHANG Li-guo1,2, AI Bing-ling3, LI Jian-zheng4, BAN Qiao-ying1,2*

(1.College of Environment and Resource Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Shanxi Laboratory for Yellow River, Taiyuan 030006, China；3.Haikou Experimental Station, Chinese Academy Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China；4.School of Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China)., 2021,41(5)：2196～2202

To improve the hydrogen production activity of anaerobic sludge, the effects of redox mediators (ROMs) on the hydrogen production efficiency of anaerobic sludge using glucose as substratewere investigated by batch culture. The microbial community structure was revealed by Illumina MiSeq sequencing. The results showed that the cumulative hydrogen production and maximum hydrogen production rate (max) of the control were respectively 11.0mL and 0.28mL/h under conditions of the fermentative volume of100mL and the initial glucose concentration of 500mg/L. When humic acid and anthraquinone-2-sulfonic acid (AQS) as ROMs were added to the system, the hydrogen production capacity of anaerobic sludge was significantly improved. The cumulative hydrogen production was higher than the control by 56.4% and 13.6%, respectively. Whilemaxwas increased by 53.6% and 10.7%, respectively. On the contrary, the hydrogen production capacity of anaerobic sludge was inhibited when graphene oxide (GO), hennaquinone and anthraquinone-2,6-disulfonic acid (AQDS) were used as ROMs. Illumina MiSeq sequencing revealed that the dominant microbial groups from each sample were different.,,,andwere the dominant genera in control. The major genera were shifted to,andin humic acid, AQS and hennaquinone fermentation systems. While,,andbecame the predominant genera in AQDS and GO fermentation systems. Redundancy analysis indicated that hydrogen production was positively correlated with,,,and, whereas negatively correlated with,,and.

anaerobic sludge；redox mediators；hydrogen production by fermentation；microbial community

X703.5

A

1000-6923(2021)05-2196-07

张立国(1980-),男,河南安阳人,副教授,博士,主要从事废水厌氧生物处理.发表论文30余篇.

2020-09-15

国家自然科学基金资助项目(51708341,51708548);哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室开放基金项目(QA202137)

* 责任作者, 副教授, banqiaoying@163.com