张晓军，杨文静，畅志坚，常利芳，闫贵云，张树伟，李 欣，乔麟轶，郭慧娟，雷梦林，贾举庆，穆志新

(1.山西农业大学农学院/作物遗传与分子改良山西省重点实验室, 山西太原 030031; 2.山西农业大学农业基因资源研究中心/农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室, 山西太原 030031)

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(PucciniastriiformisWest.f.sp.triticiEriks.)引起的一种严重威胁世界小麦生产的气传性真菌病害[1]，具有传播速度快、变异频率高、危害程度大等特点[2]。该病害发生时，一般年份可造成小麦减产5%～25%，严重时甚至绝收[3]。条锈病是中国小麦生产的重要病害之一，常年发病面积约为600万hm2，占全国小麦总面积的四分之一，严重威胁着中国小麦生产的安全[4]。抗病品种的选育与应用是控制条锈病危害的有效途径[5]，但由于小麦条锈菌毒性的快速变异，致使大多数品种抗性被条锈菌新小种所克服而不能持久利用。近年来由于条锈菌毒性小种CYR34的出现与流行，使中国原有抗源材料繁六、洛夫林10、水源86和贵农22等相继丧失抗性[6]，CYR34已成为当前中国小麦条锈菌重要的优势小种，存在条锈病大面积暴发的风险。因此，利用有效抗病基因快速选育抗条锈病品种成为当前小麦生产上亟待解决的重要问题。

分子标记可从DNA水平上追踪与鉴定抗病基因，进行抗病性选择时不受环境影响。利用分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection，MAS)可实现抗病基因在品种选育中的快速应用，有助于在生产上合理布局抗病基因和延长抗病品种使用年限[7]。目前，分子标记技术已在小麦抗病遗传改良中得到广泛应用。Robert等[8]利用SCAR(sequence characterized amplified regions)标记SC-Y15将Yr17基因转入面包小麦品种中，改良了法国面包小麦的条锈病抗性。曾祥艳等[9]利用分子标记技术结合回交转育的方法，将抗条锈病小麦种质YW243中的抗条锈病基因YrX转入普通小麦中，选育出抗条锈病小麦新品系CB032。但是，有些抗病基因的连锁标记仅在基于特定材料构建的遗传群体中有效，常随着遗传背景的改变失去作用，因而，利用不同品种构建的群体对现有标记在不同遗传背景中的有效性及选择的准确率进行评价是非常必要的[10]。

Yr69的载体品系CH7086来源于组合“中8701/小偃7430//冀麦26///冀麦26”的BC2F7品系，对CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、CYR34(G22-9)等多个小麦条锈菌小种表现为高抗或免疫，目前，Yr69是中国条锈菌优势流行小种的有效抗病基因。Hou等[11]利用分子标记将CH7086的抗条锈病基因Yr69定位于小麦2AS染色体上，筛选到8个与Yr69连锁的分子标记，其侧翼分子标记分别为X2AS33和Xmag3807，与Yr69的遗传距离分别为1.9 cM和3.1 cM。为了验证Yr69连锁标记在其他遗传背景中的有效性，本研究利用Yr69的8个连锁标记，对长4738和CH7086(Yr69)构建的F2群体进行检测，并利用小麦条锈菌接种F2:3家系鉴定条锈病抗性，以期评价标记检测的有效性，为Yr69在小麦育种中的抗性遗传与分子标记辅助选择育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料CH7086由山西省农业科学院作物科学研究所提供。国审小麦品种长4738由山西省农业科学院谷子研究所提供，经成株期鉴定高感条锈病。由“长4738/CH7086”构建的372个F2群体用于分子标记检测，F2:3家系用于抗条锈病测定。条锈病鉴定所用条锈菌小种CYR32、CYR33和CYR34，与感病对照品种Taichung 29和条锈病诱发品种川育12均来自四川省农业科学院作物研究所。

1.2 分子标记

8个与Yr69连锁的分子标记用于基因型检测[11]，分别为Xbarc124、Xwmc25、Xwmc382、Xmag3807、Xgwm210、Xgpw7101、Xgwm636和X2AS33，其中Xwmc382、Xgwm210、Xgwm636和X2AS33为共显性标记，其他4个为隐性标记。引物信息见表1。

表1 与抗条锈病基因 Yr69连锁的分子标记信息

1.3 DNA提取与PCR扩增

剪取三叶期幼苗叶片，置于2 mL离心管中，液氮冷冻后用研磨棒研磨成粉末，采用改良CTAB法[12]提取基因组DNA。利用Nanodrop 2000分光光度计(赛默飞，美国)测定DNA浓度，取少量DNA原液稀释至50 ～ 80 ng·μL-1用于PCR扩增，其余DNA原液置于-20 ℃保存。

PCR反应体系为10 μL，包括DNA模板2.0 μL，10×PCR buffer 1.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 0.7 μL，25 mmol·L-1MgCl20.7 μL，50 μmol·L-1引物0.7 μL，5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.1 μL，ddH2O 4.8 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，退火 45 s，退火温度见表1，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。PCR扩增产物加入2 μL 6 × loading buffer, 混匀后用8%(m/v)非变性聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶N,N′-甲叉双丙烯酰胺= 29∶1)电泳分离PCR扩增产物，电泳条件为恒压220 V，电泳时间50 min，硝酸银染色30 min后拍照并统计电泳带型。

1.4 抗条锈病鉴定

采用成株期鉴定的方法，于2016-2018年在四川省农业科学院现代农业科技创新示范园进行。2016年10月30日至11月10日，将长4738、CH7086及其杂交F2群体播种于田间，行长2 m，行距25 cm，每行播种20粒，每隔10行播种1行对照品种Taichung 29，每行两端和试验田四周条播川育12用于诱发条锈病。翌年1月中旬，采用喷雾法[13]接种等量混合的小麦条锈菌小种CRY32、CRY33和CYR34[14]的夏孢子悬浮液。约3月中下旬，待感病品种条锈病充分发病时，调查亲本及F2群体每个单株对条锈病的反应型，调查方法采用0 ～ 9级的分级标准[15]，其中0级为免疫，1 ～ 6级为抗病，7 ～ 9级为感病。

F2群体按单株收获后，2017年将其F2:3家系再次播种，每个家系播种1行，每行播种20粒，随机区组设计，设3次重复。采用与上述相同的接种方法与鉴定方法，调查F2:3家系每个单株对条锈病的抗性反应。根据F2:3家系中植株对条锈病的抗、感反应推导其F2单株的基因型。

2 结果与分析

2.1 F2与F2:3家系的条锈病抗性

用小麦条锈菌混合小种对“长4738/CH7086”的372个F2群体接种鉴定结果表明，表现为抗病的植株数量为287个，表现为感病的植株数量为85个。其F2:3家系的鉴定结果表明，在287个抗病F2植株的F2:3家系中，有89个表现为纯合抗病；98个则表现为杂合性，存在抗、感病分离。

2.2 F2群体基因型的分离规律

基因型检测结果(表2)表明，4个共显性标记Xgwm636、Xgwm210、Xwmc382和X2AS33在“长4738/CH7086”F2群体中的检测结果符合 1∶2∶1的分离比；4个隐性标记Xwmc25、Xmag3807、Xgpw7101和Xbarc124符合1∶3的分离比。以上结果说明，Yr69在“长4738/CH7086”的F2群体中符合显性单基因遗传规律。

表2 Yr69连锁标记基因型在“长4738/CH7086”F2群体中的分离规律

2.3 分子标记鉴定的准确性

利用Yr69连锁标记筛选出的纯合抗病基因型家系中，4个共显性标记Xgwm636、Xgwm210、Xwmc382和X2AS33基因型与表现型符合率分别为76.0%、83.3%、86.3%和96.7%；4个隐性分子标记Xwmc25、Xmag3807、Xgpw7101和Xbarc124的基因型与表现型符合率分别为87.5%、90.5%、83.0%和71.2%(表3)。

利用8个连锁标记都可在“长4738/CH7086”的遗传群体中检测到抗条锈病基因Yr69，所筛选到纯合抗病基因型的株系数量随着分子标记与Yr69连锁遗传距离的增加而逐渐增多，但实际上其所含有的纯合抗病表型株系数量却呈现减少的趋势，且表型与基因型符合率(表型与基因型符合率=纯合抗病表型株系数/纯合抗病基因型株系数×100%)，以及对纯合抗病株系的筛选率(检测率=筛选出的纯合抗病株数/纯合抗病表型株系数×100%)也呈现逐渐减少的趋势(表3)，表明分子标记在检测群体中表现型与基因型的符合率与其与Yr69的遗传距离有关。其中，X2AS33筛选出的91个纯合抗病基因型家系中，有88个表型为纯合抗病，3个表型为纯合感病或抗感分离，表型与基因型的符合率为96.7%；同时在整个群体的89个纯合抗病家系中，X2AS33筛选出的88个，仅1个家系的基因型与抗病性鉴定结果不符，检测率为98.9%。这表明，标记X2AS33在8个连锁标记中对Yr69的检测准确度最高，是Yr69较理想的连锁分子标记。X2AS33的PCR扩增带型见图1，可以看出，纯合抗病基因型AA家系的目的条带与Yr69的载体品系CH7086一致，进一步说明使用标记X2AS33对抗条锈病基因Yr69的检测效果较好，可用于该基因的分子辅选择育种。

M：Marker；P1：CH7086；P2：长4738；1～10：AA基因型家系；11～20：aa基因型家系。

表3 Yr69连锁标记检测抗病株系的有效性

3 讨 论

迄今，国际上已鉴定出83个正式命名的抗条锈病基因[16]，这些基因多为质量性状基因。随着条锈菌毒性的不断变异，含该类抗条锈病基因的品种在生产上大面积种植后极易丧失抗条锈性[17]。将不同抗病基因聚合到同一品种中，可提高该品种的抗病性并延长其使用年限，是解决这一生产问题的有效措施[18]。目前，国内外已获得大量与抗条锈病基因相关的分子标记，除Yr5[19]、Yr7[19]、Yr10[20]、Yr15[21]、Yr18[22]、Yr36[23]、Yr46[24]等少数克隆基因已获得共分离标记外，大多数分子标记是基于特定遗传群体进行染色体定位而获得的连锁标记，这些连锁标记往往需要在特定的遗传背景中才能有效鉴定目标基因，在用于分子标记辅助育种时需要用不同遗传背景的分离群体验证其检测目的基因的有效性。

Yr69对小麦条锈病多个小种具有优良抗性，利用生产品种检测其连锁标记在不同遗传背景中的有效性，可为Yr69的分子标记辅助育种提供必要的参考。长4738具有丰产性突出、稳产性好、适应性广的特点，但因其高感条锈病、叶锈病和秆锈病[25]，使其在生产上的应用受到限制。利用“长4738/CH7086”群体既可以检测Yr69连锁标记在其他遗传背景中的有效性，也可为抗条锈病育种提供候选材料。本研究结果表明，Yr69的8个连锁标记在长4738背景中都可以进行抗病基因筛选，其中X2AS33与Yr69的连锁距离最小，检测的准确率也最高。Peng等[26]认为使用与目的基因遗传距离小于2 cM的分子标记，可以获得90%以上的鉴定效率。本研究使用的4个共显性标记中，仅有X2AS33与Yr69的遗传距离小于2 cM，利用其筛选得到的91株AA基因型家系中，有88株表现为纯合抗病，基因型与表型的符合率达到96.7%，这表明，在“长4738/CH7086”群体中使用X2AS33进行抗条锈病基因Yr69的鉴定可获得较理想的筛选效果。

隐性分子标记在PCR扩增纯合抗病植株时表现为带型缺失，且无法区分杂合抗病株系与感病株系，往往用于反向推理抗病基因的存在与否，在分子标记辅助选择中的应用受到很大限制。因此，虽然4个隐性分子标记Xmag3807、Xwmc25、Xgpw7101和Xbarc124在“长4738/CH7086”杂交群体中也可以获得较高的鉴定效率，但其易受遗传背景的影响，在分子标记辅助育种中应尽量避免使用隐性标记。

在两个品种杂交后代的基因组发生交换时，分子标记与目标基因会发生一定概率的重组，重组率越低则选择效率越高，其选择效率受标记与目标基因遗传距离的限制[27]。因此，利用连锁标记选择抗病基因时，应尽可能使用与目标基因遗传距离较近的侧翼标记。为获得更高的分子标记选择效率，还需进一步开发与Yr69紧密连锁的标记或共分离标记，构建Yr69的高密度饱和遗传图谱，这对实现Yr69的精细定位或克隆是十分必 要的。