王巧慧，谷建华，郭 欢，吕士凯，吉万全,张 宏

(1.西北农林科技大学农学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100； 2.陕西省留坝县种子管理站，陕西留坝 724100)

小麦作为人类主粮之一，为人类提供五分之一的能量营养供给[1]，是全球贸易总额超过其他所有作物总和的经济作物[2]。但由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeriagraminisf. sp.tritici)引起的小麦白粉病造成小麦严重的产量损失，在中国部分地区白粉病可导致小麦高达40%的减产[3-4]。据估计，截至2050年，小麦产量每年需增加2.4%才能满足未来人类的粮食需求，而目前粮食增产仅为0.9%[5]。因此，提高小麦抗白粉病能力、降低白粉病的感染面积和发病程度可有效增加小麦产量。

探明白粉菌的侵染机制和小麦抗病的分子机制，是利用分子技术培育抗病品种的基础。小麦抗病的遗传基础分为单基因抗性和多基因抗性[6]，白粉菌小种的不断变异导致抗病小麦品种抗性丧失，因此，需在抗性基因库中不断发现新的抗性基因。随着基因组测序的快速发展，功能组学研究也成为热门，研究蛋白质功能的其中一个方法就是找出与其互作的蛋白，构建互作网络。大多数蛋白都存在蛋白质-蛋白质相互作用，与之相互作用的蛋白质也被认为参与同一细胞内的相同生物过程，从而对探究未知蛋白质的功能提供线索。酵母双杂交技术是一种可高通量检测蛋白质-蛋白质相互作用的细胞内检测技术[7]，该技术可检测微弱的或是短暂的相互作用，还可以提供对蛋白质稳定和正确折叠所必须的修饰。cDNA的便于克隆和大量表达，使得从cDNA文库中筛选到所需的目的基因以及构建蛋白质互作网络更加便捷。因此，为解析小麦防御机制，构建白粉菌侵染下小麦的cDNA文库就显得更加重要。

热激蛋白在植物体中广泛存在，依据分子量的不同，可将其分为小分子量热激蛋白和大分子量热激蛋白[8-9]。近年来研究发现，热激蛋白不仅在高温、低温、干旱、盐等非生物胁迫下大量积累，而且还参与抗病虫害信号传导过程，在生物胁迫中也发挥重要作用。王付娟等[10]研究发现，热激蛋白与其他蛋白具有分子伴侣功能，在其他辅助伴侣蛋白作用下促进蛋白质的正确折叠，在逆境胁迫下参与信号转导过程。HSP40-70是一种广泛存在于生物体内的大分子量热激蛋白，有助于蛋白质折叠和分解，防止蛋白质错误折叠或聚集[11]。因此，本研究利用酵母双杂交技术，筛选小麦酵母文库，得到与抗逆蛋白HSP40-70互作的蛋白，并分析该蛋白功能，以检测该文库的可用性和准确性，以期为植物抗逆机制研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为小麦种质N9134，由阿勃非整倍体与野生二粒小麦AS846杂交选育而成，该材料对中国境内目前所有的白粉病菌生理小种都表现为高抗至免疫。将其种植于18 ℃光照16 h/黑暗8 h的人工培养箱中，待长至三叶期时，接种白粉病菌小种BgtE09，48 h后进行取样。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取

接种白粉病菌48 h后，剪取小麦叶片，设置三个生物学重复。使用Takara MiniBEST Plant RNA Extraction kit(TaKaRa，Code No. 9769)试剂盒提取总RNA。用NanoDrop检测总RNA的浓度和纯度，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。然后对样品的总RNA进行纯化，供后续构建cDNA文库。

1.2.2 cDNA第一链和第二链的合成

取1.0 μg RNA，用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech，Code No.634901)试剂盒合成第一链cDNA。用LD-PCR(long distance PCR)法根据Advantage 2 PCR Kit试剂盒说明书来扩增合成第二链cDNA。

1.2.3 cDNA文库均一化处理及扩增

使用TRIMMER DIRECT cDNA Normalization Kit(Evrogen，Cat # NK003)试剂盒对纯化后的cDNA进行均一化处理，由于在加入已知配体修饰的ds-cDNA变性后，复性过程中拷贝数高的转录产物变为ds-cDNA的速率远高于低拷贝数的转录产物，因此，利用双链特异核酸酶(DSN)降解ds-cDNA片段可达到均一化的目的[12]。对均一化处理后的ss-DNA进行PCR扩增，具体操作见Advantage 2 PCR Kit(Clontech，Code No.639206 )试剂盒说明书。

1.2.4 ds-cDNA纯化及短片段去除

使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit(TaKaRa，Code No.9761)对扩增得到的cDNA进行纯化处理，并用无菌水溶解。使用限制性内切酶SfiI对cDNA进行酶切，并使用CHROMASPIN-1000-TE对酶切后的cDNA过柱处理，去除短片段，经PCI/CI净化和乙醇精制后，用ddH2O溶解。取1 μL cDNA用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 cDNA初级文库的构建及库容检测

使用DNA ligation Kit(TaKaRa，Code No.6022)试剂盒将pGADT7-SfiI三框载体与5～10 μL过柱后的cDNA于12 ℃过夜连接，纯化后得到初级cDNA文库。取三种少量初级文库连接产物，分别电转化感受态细胞HST08，取适量转化产物分不同浓度梯度涂布于Amp+抗性的LB平板上，37 ℃过夜培养，通过观察平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。

1.2.6 cDNA文库插入片段的电泳分析及次级文库构建

分别取三种读码框文库滴定后的平板，分别随机挑取16个单菌落，使用pGADT7载体的通用引物(pGADT7-F：5′- GGAGTACCCATACGACGTACC -3′，pGADT7-R：5′- TATCTACGATTCATCTGCAGC -3′)对文库插入片段进行分析，用1.5%的琼脂糖凝胶进行片段大小检测。随机选取96个单克隆测序来验证均一化的效果。然后根据库容检测数据，取三种读码框文库共1×106克隆，根据电转化大肠杆菌感受态细胞说明书，计算需要的连接产物体积，电转化至感受态细胞HST08中，涂布10个LB平板， 37 ℃过夜培养，并挑单菌落进行摇培，使用NucleoBond Xtra Midi EF(MNG，Code No.U0420B)试剂盒提取质粒，取100 ng质粒用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.7 HSP40诱饵载体的构建及自激活检测

使用BamHI限制性内切酶单酶切诱饵载体pGBKT7使其线性化，用诺唯赞同源重组试剂盒将热激蛋白HSP40-70基因和线性化载体连接。采用PEG/LiAc法转化重组诱饵载体pGBKT7-HSP40至Y2HGold酵母感受态中，涂布在SD/-Trp固体培养基上，29 ℃培养3～5 d。挑取单克隆并稀释10、100、1 000倍后分别点于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade固体培养基上，29 ℃培养3～5 d。如果SD/-Trp/X-α-Gal培养基中菌落颜色未变蓝，且SD/-Trp/AbA和SD/-Trp/-His/-Ade培养基无菌落生长，可判断该热激蛋白不能自激活，可作为诱饵筛选酵母文库。

1.2.8 以HSP40-70为诱饵筛选酵母文库及互作蛋白的回转验证

挑取SD/-Trp固体培养基上含pGBKT7-HSP40-70的酵母菌落至100 mL的SD/-Trp液体培养基，29 ℃摇培至OD600=0.8左右，室温离心弃上清，收菌至4 mL的SD/-Trp液体培养基中悬浮。与1 mL双杂交文库菌液混合转入含45 mL 2×YPDA液体培养基的1 L锥形瓶中，缓慢震荡培养。融合20 h后，用光学显微镜观察酵母有无结合体出现。若出现，用50 mL 0.5×YPDA冲洗锥形瓶2次，离心弃上清，收集菌体至5 mL 0.5×YPDA，涂板于SD/-His /-Ade/X-α-Gal/AbA培养基上，29 ℃培养3～5 d。挑取长出的单菌落划线至SD/-Trp /-Leu/ -His/-Ade固体培养基上，进行二次筛选，生长良好并显蓝的单菌落即为候选互作蛋白[13]。将候选互作蛋白转至QDO液体培养基扩繁菌体，使用天根酵母提取质粒盒提取酵母质粒。将所提质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态中，使用pGADT7载体的通用引物进行菌落PCR检测，挑取阳性克隆送往杨凌奥科生物公司测序。测序结果经NCBI比对，若读码框正常，则进行下一步实验。将质粒分别与pGBKT7-HSP40-70载体回转至酵母菌Y2HGold中，并涂布于SD /-His/-Ade培养基上。挑取单菌落，稀释10、100、1 000倍后点在QDO/X/A培养基上，若酵母菌正常生长并显蓝色，则为真实互作蛋白。阳性对照为共转pGBKT7-53和pGADT7-T两种质粒的酵母菌，阴性对照为共转pGBKT7-Lam和pGADT7-T两种质粒的酵母菌[14]。

1.2.9 序列分析

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST数据库分析与HSP40-70诱饵蛋白的互作蛋白[15]。

2 结果与分析

2.1 N9134的苗期抗白粉病抗性表现

室内条件下，与小麦苗期接种BgtE09，结果(图1)表明，对照陕优225的反应型为4级，表现为高感；N9134的反应型为0级，表现为免疫。

A：陕优225(对照)；B：N9134。

2.2 总RNA的提取

提取N9134的总RNA，经分光光度计检测，其OD260/280比值为2.01，OD260/230比值为2.20，表明RNA纯度较高。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，能观察到总RNA中28S和18S两条带，表明RNA完整(图2)，可用于下一步文库构建。

图2 N9134叶片总RNA的电泳检测结果Fig.2 Electrophoresis analysis of total RNA extracted from the leaves of N9134

2.3 ds-cDNA合成与鉴定结果

对合成的cDNA进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图3A)发现，ds-cDNA片段主要分布在300～3 000 bp之间，且在大约1 500 bp处条带最亮，表明不同大小片段的mRNA均进行反转录，且在1 500 bp处的mRNA转录产物量较高。

2.4 ds-cDNA的均一化处理结果

从图3B可以看出，经过均一化处理的ds-cDNA已经没有较亮的特异条带，在2 500 bp以下呈现出亮度均匀的弥散条带，表明不同片段的转录产物拷贝数已被调节至相似数量。

2.5 ds-cDNA SfiI酶切处理及短片段去除结果

从图3C可以看出，SfiI酶切处理及短片段去除处理后，基本去除了500 bp以下的短片段，保留的长片段增加了包含完整ORF的可能，保证了插入片段信息的质量，使得文库构建更加 高效。

2.6 初级cDNA文库构建及库容检测结果

将pGADT7-SfiI三框载体与处理后的 cDNA过夜连接后，得到初级cDNA文库，然后电转化至感受态细胞并涂板，通过观察不同稀释浓度梯度平板上的菌落个数，计算出初级文库库容为：读码框1文库约大于1.0×106cfu·mL-1，读码框2文库约大于1.1×106cfu·mL-1，读码框3文库约大于1.2×106cfu·mL-1，库容量满足筛库要求。

2.7 初级cDNA文库插入外源片段检测及次级文库构建结果

通过pGADT7载体检测引物扩增随机选取的三种读码框菌落，结果(图4)发现，插入片段的大小分布范围为400～2 000 bp，平均大于1 000 bp；重组率约为100%。对初级文库的96个单克隆进行测序，发现有3个冗余序列，冗余率约3%。根据库容检测数据，取1×106个克隆的连接产物，电转化后涂板，并回收菌落提取质粒，取100 ng扩增文库质粒进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，发现条带大小一致，说明提取质粒质量较好，核酸浓度检测仪显示其浓度大小为1 μg·μL-1，证明文库扩增质量较好。

2.8 HSP40-70诱饵载体及自激活检测结果

将构建的诱饵载体pGBKT7-HSP40-70转化到酵母菌菌株Y2HGold中，将转化后的单菌落稀释10、100、1 000倍后点于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培养基上，发现在SD/-Trp培养基上酵母菌生长良好，加入X-α-Gal后无显色反应，且在SD/-Trp/AbA和SD/-Trp /-His/-Ade培养基上均无酵母菌生长(图5)，说明热激蛋白HSP40-70诱饵载体不能自激活报告基因，可以进一步通过酵母双杂交方法筛选构建成功的cDNA文库。

2.9 诱饵载体筛选文库及互作蛋白梯度稀释验证结果

将转有pGBKT7-HSP40-70的Y2HGold菌株与小麦双杂交酵母文库杂交，当出现结合体时，将其涂布在DDO/X/AbA培养基上，得到5个生长正常且显蓝色的单菌落。将这5个单菌落溶于ddH2O中，并在QDO平板上划线培养，发现初筛编号为3的酵母菌没有生长，其余4个编号的酵母菌均长势良好(图6)，说明这4个编号的酵母菌含有热激蛋白HSP40-70的候选互作蛋白。在QDO液体培养基中扩繁长势良好的候选酵母菌，并提取酵母质粒，转化至大肠杆菌并进行菌落PCR检测后，将阳性菌落摇培后送公司测序。利用NCBI分析互作蛋白的测序结果后，本研究选取编号为2和4的2个候选酵母菌进行浓度梯度稀释验证。将pGADT7 重组载体分别与pGBKT7-HSP40-70载体共同转化至酵母Y2HGold菌株中，将其涂布在SD /-His/-Ade培养基上。挑取长出的单菌落稀释10、100、1 000倍后点至QDO/X/A培养基上，发现酵母菌正常生长并显蓝色(图7)，说明这2个候选蛋白与诱饵蛋白>HSP40-70存在互作关系，该小麦酵母文库后续可应用于蛋白互作筛选。

M：250 bp DNA Ladder Marker；1：ds-cDNA；2：均一化ds-cDNA；3：SfiI酶解的ds-cDNA。

M：250 bp DNA ladder marker；1～48：插入外源片段电泳检测。

图5 HSP40-70诱饵载体的自激活检测Fig.5 Self-activation detection of HSP40-70 decoy carrier

图6 HSP40-70互作蛋白的筛选Fig.6 Screening for interacted protein of HSP40-70

图7 HSP40-70与候选蛋白的互作验证Fig.7 Interaction verification between HSP40-70 and candidate proteins

2.10 互作蛋白的功能注释

使用NCBI BLAST和UniProt BLAST对2个候选蛋白的ORF序列进行比对分析，结果(表1)发现，编号为2的蛋白为DnaJ类蛋白，编号为4的蛋白编码E3泛素蛋白连接酶AIP2。

3 讨 论

制备高质量的酵母双杂交cDNA文库是进行大规模筛选候选互作蛋白的基础[16]。cDNA文库的构建具有器官、组织或细胞特异性，由于白粉病的发病部位为叶片，因此，本试验材料选用白粉病侵染后的叶片，确保了叶片部位特异表达基因的最大化收集。高质量的RNA是构建高质量cDNA文库的前提，本研究中所提取的RNA电泳检测显示有清晰的28S及18S两条带，说明所提的RNA质量高。cDNA文库质量评价有两个重要的指标，即文库的库容和重组序列的完整性。本研究中三框文库的库容均大于有效文库的浓度要求1.0×106cfu·mL-1，且构建的文库重组率为100%，插入片段分布在400～2 000 bp，大小不同且大片段居多，说明本研究构建的文库完全满足高质量文库的要求。本研究使用热激蛋白HSP40-70诱饵蛋白对该小麦酵母文库进行筛选，最终筛选到DnaJ类似蛋白和E3泛素蛋白连接酶AIP2与其互作。DnaJ蛋白属于热激蛋白的分子伴侣，参与大部分细胞过程[17]。泛素蛋白酶体途径是所有真核生物体生长发育以及应对胁迫的重要途径，泛素连接酶E3特异性识别靶蛋白，在该途径中具有重要的作用[18-19]。本研究中HSP40-70和E3泛素蛋白连接酶AIP2互作，说明HSP40-70参与植物胁迫应答过程。综上所述，本研究构建的小麦酵母文库可应用于后续的蛋白互作筛选。

本研究采用的SMART酵母文库构建体系使得试验步骤更加简洁。Zhang等[20]研究发现，同时依赖DSN酶降解ds-cDNA和DNA-RNA杂交链的特性来均一化转录产物，使较短的基因片段也能保留下来。本研究构建的三框cDNA文库是在单一cDNA文库的基础上，增加碱基使其读码框后移一位或两位，从而使cDNA出现三种读码方式，保证捕捉到生物体内真实的读码方式[20]。在白粉菌侵染小麦的过程中，会触发一系列免疫以及抗病反应，我们既可利用已知的候选蛋白和cDNA文库去筛选相关的互作蛋白，构建互作网络，也可以利用白粉菌某些毒性蛋白来快速获取小麦体内的病原菌应答蛋白，从而为探明病菌侵染与植物防御的分子机制奠定基础。

表1 互作蛋白的NCBI BLAST结果Table 1 NCBI BLAST results of the interacting proteins