胡 丽，陈 敏，殷高方，赵南京，甘婷婷

1.合肥师范学院物理与材料工程学院，安徽 合肥 230061 2.中国科学院安徽光学精密机械研究所中科院环境光学与技术重点实验室，安徽 合肥 230031 3.中国科学技术大学研究生院科学岛分院，安徽 合肥 230026

引 言

随着现代化农业的快速发展，各种各样除草剂被过量使用，大量残存的除草剂进入水环境中，给流域生态环境、水产养殖和饮水安全带来巨大威胁[1]。区别理化分析方法，水质生物毒性检测方法利用生物在胁迫条件下的生理或行为等变化衡量污染物毒性，能综合反映污染物对生态系统的危害程度，满足生态环境风险评估需求[2]。藻类作为单细胞生物，其个体小、繁殖快、对毒物敏感、易于培养，是水质生物毒性检测的理想受试生物[3]，国际经合组织将“藻类生长抑制试验”列为化学品毒性测试标准方法，以96h作用下藻类细胞密度生长的半数抑制效应浓度(EC50)来表征急性毒性作用的程度。然而，“藻类生长抑制试验”依赖于藻类细胞的繁殖代谢过程，毒性响应慢，测量周期长[4]，已有研究表明细胞形态结构破坏、细胞酶活性变化、遗传物质损伤等抑制细胞生长因素都会作用于光合作用过程[5]，其响应速度和灵敏度明显优于“藻类生长抑制试验”[6]。近年来，人们开展了一些污染物毒性的藻类光合抑制实验，荧光测量多跟随国外技术(如PAM[7])，获得的光合荧光参数大多与可变荧光Fv或最大光化学量子产量Fv/Fm有关。已有研究也多选用Fv或Fv/Fm表征藻类受胁迫程度[8]，如Mallick等[9]实验证明(F0/Fv)是评估重金属毒性的最佳参数；Pérez等[10]研究认为可变荧光(Fv)对Cu2+胁迫响应最为快速敏感；Tiam等[11]研究表明快速光响应曲线的反演参数Yield(光照状态下PSⅡ的实际量子产量)对农药毒性更敏感，是较好的藻类生物毒性反应终点。然而，随着研究的深入，研究者发现不同类型污染物对藻类细胞产生毒性效应的光合作用位点和损伤程度具有明显差异，与之对应的敏感荧光参数差异较大[12]。现有研究采用单一、固定的光合荧光参数作为生物毒性反应终点，缺乏对多个光合荧光参数响应敏感性的对比分析，造成生物毒性定量检测的灵敏度不高。因此，针对特定污染物(如除草剂)，在准确获得多个光合荧光参数的基础上，如何从众多的光合荧光参数中筛选出能够精确反映其抑制效应的关键参数，成为当前该领域急需解决的问题。

本研究以蛋白核小球藻为受试对象，以叶绿素荧光作为藻类光合作用状态快速无损探针，采用荧光动力学手段测量藻类光合荧光参数，对典型除草剂敌草隆(dichlorophenyl dimethylurea，DCMU)抑制下的多个光合荧光参数的毒性响应敏感性进行对比分析，得到适用于快速、定量评价DCMU胁迫效应的关键光合参数，提高DCMU生物毒性检测的速度和灵敏度。

1 实验部分

1.1 藻种培养与溶液配制

实验选取的蛋白核小球藻选种及扩大培养方法同参考文献[8]，实验在100 mL三角锥形瓶中进行，量取藻液50 mL，实验藻类初始叶绿素浓度控制在100～200 μg·L-1，DCMU胁迫物的添加体积为1 mL(排除藻液稀释造成的干扰)，根据预实验结果，DCMU抑制液浓度梯度设定为1，2，5，10，20，40，80和160 μg·L-1，每个样品设置3个平行样。

1.2 光合荧光参数及获取

藻类光合荧光参数通过可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪(AGHJ-TPLIF-I，中国科学院安徽光学精密机械研究所研制)测量[13]。该仪器通过测量水体藻类叶绿素荧光动力学曲线及光合响应曲线(FLC曲线)，能够在数十秒内准确反演获得表征藻类光合作用过程特征的光合荧光参数，仪器主要功能结构如图1所示，得到的光合荧光参数如表1所示。

图1 可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪结构示意图Fig.1 Schematic diagram of chlorophyll fluorescence analyzer induced by variable light pulse

表1 可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪测量得到的光合荧光参数Table 1 Photosynthetic fluorescence parameters acquired by the chlorophyll fluorescence analyzer

光合荧光参数对DCMU的响应结果以抑制率和促进率表征，分别用Y抑制和Y促进表示，其计算公式见式(1)和式(2)[14]

(1)

(2)

式中，X0为对照组光合荧光参数数值；Xi为实验组光合荧光参数数值。

2 结果与讨论

根据预实验结果，选取DCMU胁迫5 min后的对照组和实验组12个光合荧光参数，利用成对样本T检验得到实验组与对照组的显著性差异，初步筛选有显著性响应的参数。结果表明，DCMU在蛋白核小球藻的多个光合作用位点都产生了抑制，10个光合荧光参数F0，Fm，σPSⅡ，τQA，Fv，Fv/Fm，Yield，rP，NPQ，α存在显著性差异；JVPⅡ和Ek在测量浓度范围内出现了中浓度区域显著响应，但低浓度和高浓度区域非显著性响应，不适宜作为生物毒性定量检测的响应指标。因此，选取上述10个显著响应参数，进一步研究DCMU毒性作用下的时间和剂量效应关系。

2.1 时间效应关系

根据预实验结果，实验测试周期设置为5 min，1 h，3 h，6 h，24 h，48 h，72 h和96 h，得到10个显著响应参数在DCMU抑制下的时间-效应变化规律。同时，为了比较光合抑制和生长抑制的差异，以藻类叶绿素含量(chlorophyll，Chl，可变光脉冲诱导叶绿素荧光分析仪测量)代替藻类生物量，得到DCMU抑制下的藻类生物量随时间的响应规律。

结果表明，10个光合荧光参数可分为三类：第一类为表征藻类生长状态的参数α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ，各参数的时间-效应趋势大致相同，如图2所示。样液的抑制率在测量周期内呈现出先下降的趋势，6 h后抑制率达到最低值；后呈现上升趋势，48 h后基本趋于稳定，且此时的抑制率值基本和5 min的测量值持平。6 h内抑制率下降可能与受试藻类毒性胁迫自适应有关，但藻类细胞自适应能力达到极限后，毒性胁迫效应将随时间延长呈增加趋势，直至稳定，这与文献[8]研究结果一致。因此，考虑到生物毒性快速测量需求，可以选择5 min作为定量测量的时间节点，此时的测量数据可以代表长期(如96 h)抑制效果。

图2 光合荧光参数α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ时间响应变化趋势Fig.2 The variation trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with time

第二类为F0，Fm和Fv，结果如图3所示。在整个测量周期内，低浓度样液呈现出刺激生长效应，在48 h后趋于稳定；而中高浓度样液呈现先促进后抑制的效应，6 h为时间拐点，之后抑制率随时间呈累积增长效应，在48 h后趋于稳定，这种先促进后抑制的趋势类似第一类参数，与藻类毒性胁迫短期内的自适应效应和胁迫极限有关。同时，对比上述参数和藻类生长抑制的时间响应规律(即chl-a含量随时间的变化趋势)，发现其响应规律类似，说明参数F0，Fm和Fv除了与藻类的生长状态有关外，还与藻类生物总量有关。因此，第二类参数同藻类生长抑制方法，适合选取较长时间为定量测量的时间节点(如48 h)，以获得较为稳定、精确的测试结果。

图3 光合荧光参数F0，Fm、Fv和Chl时间响应变化趋势Fig.3 The variation trend of F0， Fm， Fv and Chl with time

第三类为光合参数σPSⅡ和τQA，此类参数的抑制率值在整个测量周期内都是负值，为研究方便，使用促进率表征参数对DCMU的响应规律，如图4所示。样液的促进率在6 h内呈现出下降的趋势，6 h后随时间延长累积变化较小，基本趋于稳定。因此，可以选择6 h作为第三类参数毒性测量的时间节点，确保此时的测量数据与长时间测量数据保持一致，避免短时测量出现假阳性的结果。

图4 光合荧光参数σPSⅡ和τQA时间响应变化趋势Fig.4 The variation trend of σPSⅡ and τQA with time

综合三类参数的时间响应规律，考虑到DCMU生物毒性快速测量的需求，选取5 min作为测量的时间节点，第一类参数Yield，rp，α，Fv/Fm和NPQ作为定量测量的关键光合参数，进一步研究其剂量效应关系。

2.2 剂量效应关系

根据2.1节，进一步分析关键参数Yield，rp，α，Fv/Fm和NPQ在DCMU 5 min抑制时的剂量效应关系，并与96 h长时抑制的剂量效应关系进行对比，以确保短时测量结果的准确性和有效性。通常生物毒性实验获取的毒性强度与受试生物受抑制程度间的剂量-效应曲线呈现反“S”形，一般以阻滞增长模型(Logistic)为基础进行非线性拟合[15]。以抑制物浓度代表其毒性强度，光合参数的抑制率代表受试生物受抑制程度，利用Logistic函数进行拟合，得到对应的拟合相关系数及EC50值。结果显示，DCMU抑制5 min后，参数α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ抑制率对DCMU浓度具有良好的剂量效应关系(如图5)，拟合相关系数R2分别为0.996 9，0.997 3，0.998 5，0.998 5和0.998 5，由此得到的EC50-5 min值分别为10.31，11.59，13.03，13.94和2.41 μg·L-1，如表2所示。对比96 h长时抑制的剂量效应关系，结果表明参数Yield，rp，α，Fv/Fm的拟合相关系数短时效应优于长时效应，但EC50值长时效应优于短时效应。同时，实验还表明参数NPQ对DCMU毒性的响应灵敏度和响应速度极佳，其5 min抑制对应的相关系数和EC50优于其他四个参数，且优于96h的测量结果。因此，可以选取参数NPQ作为5min定量测量DCMU生物毒性的响应指标，既可大幅缩短检测时间，还可以提高检测的灵敏度。

表2 5 min和96 h抑制的拟合相关系数和EC50值Table 2 The fitting correlation coefficient and EC50 value of 5 min and 96 h inhibition

图5 5 min胁迫下α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ值随DCMU浓度的变化趋势Fig.5 The trend of α， rP， Fv/Fm， yield and NPQ with DCMU concentration under 5 min stress

3 结 论

基于藻类光合荧光参数的生物毒性监测方法，具有响应快速、参数丰富、测量简捷的特点。对DCMU抑制下的多个光合荧光参数毒性响应敏感性进行了对比分析，首先通过成对样本T检验，得到光合荧光参数F0，Fm，σPSⅡ，τQA，Fv，Fv/Fm，Yield，rP，NPQ，α显著响应；通过分析显著响应参数的时间-效应规律，得到参数α，rP，Fv/Fm，yield和NPQ在5 min即体现出类似长时抑制效应的关系，5 min可作为DCMU毒性分析的时间测量节点；最后，研究5 min胁迫下DCMU浓度与参数α，rP，Fv/Fm，yield，NPQ抑制率之间的剂量-效应关系，利用Logistic函数进行拟合，同时对比96 h长时抑制的剂量效应关系，结果显示参数NPQ的相关系数和EC50分别为0.998 5和2.41 μg·L-1，显著优于其他四个参数，且优于96 h的测量结果。因此，采用光合荧光参数NPQ作为5 min定量测量DCMU生物毒性的反应终点，可极大缩短DCMU生物毒性检测的检测时间(从数小时缩短至5 min)，并显著提高检测灵敏度(与光合抑制方法常规参数Fv/Fm相比，EC50降低了81.4%)。实验结果为基于藻类光合抑制效应的DCMU生物毒性定量检测提供了基础数据，研究方法也为其他污染物胁迫下的藻类光合荧光参数筛选提供了参考。