许佳敏 边海霞

摘要：為了更好防控H9N2亚型禽流感，且做到科学免疫，免疫减负。本研究采集疑似感染低致病禽流感鸡群病料，将其无菌处理后接种SPF鸡胚后进行病毒分离，通过分子生物学试验对其进行病原学鉴定。结果显示：分离鉴定出一株H9亚型禽流感病毒（AIV）；血凝试验（HA）效价在10～11，该病毒属于欧亚分支的BJ亚分支。将病毒纯化后，制备灭活疫苗免疫SPF鸡，免疫后14d对其进行HI检测，结果显示其效价到达峰值为10Log2，免疫后28～35d其平均效价在9.6Log2，至免疫后12周平均效价在7Log2。结果说明本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果，可以作为疫苗候选株。

关键词：H9N2亚型禽流感毒株，免疫，疫苗

禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的简称，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒属（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽类疾病[1]。国际兽医局（OIE）将禽流感列为A类动物疫病，我国也将其定为一类动物传染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亚型，在世界各地家禽群中流行。目前，H9N2引起的禽流感在我国呈地方流行，虽然死亡率低，但感染蛋鸡出现鸡输卵管功能异常，产褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、软壳蛋，鸡群产蛋率下降30%～80%，病程持续时间长的可达月余，造成严重的经济损失[2]。该疾病可通过免疫疫苗进行抵御但是由于低致病禽流感变异速度快，不同血清型之间交叉保护有限；所以筛选、免疫对型疫苗对养殖业具有重要意义[3]。本研究通过分子病原学及血清学分离鉴定一株H9N2流行毒株，并进行动物试验，为进一步筛选疫苗提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源疑似发病鸡病料，采集自宁夏平罗县某商品蛋鸡养殖场。

1.1.2试剂和设备禽流感抗H9亚型标准阳性血清由哈尔滨兽医研究所提供；OneStepPCRMix购自北京全式金生物；PCR仪购自罗氏；RNA提取试剂盒购自罗氏；高速冷冻离心机购自湘仪。

1.1.3试验动物试验用SPF鸡种蛋，购自北京勃林格英格翰公司

1.1.4引物设计参照GenBank中已发表的H9N2AIV的HA基因序列，设计一对鉴定引物，序列为：AI-F（5-3）：CTCCACACAGAGCAYAATGG；AI-R（5-3）：GYACACTTGTTGTTGTRTC；扩增基因片段大小均为488bp。测序引物系列：HA-F（5-3）：AGCRAAAGCAGGGGAATTTC；HA-R（5-3）：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；扩增基因片段大小均为1800bp。引物由上海生工生物技术有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒基因组RNA提取采集疑似发病鸡群病料及肛咽拭子；将其无菌处理后，根据罗氏病毒RNA提取试剂盒操作步骤，提取核酸。使用鉴定引物根据全式金生物一步法进行PCR扩增，扩增程序为：94℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，30个循环； 72℃10min；扩增完毕后进行凝胶电泳，观察是否有目的片段。

1.2.2病毒分离及鉴定将1.2.1无菌处理的肛咽拭子样品吸取上清，使用0.22μm滤器过滤，以0.2mL/只接种9～10日龄SPF鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，将24～96h死亡和存活鸡胚放于4℃过夜或放于-20℃2h后无菌收集尿囊液。检测尿囊液效价，对于有效价尿囊液重复1.2.1操作，扩增完毕后进行凝胶电泳，观察是否有目的片段；无效价尿囊液重复接种鸡胚。

1.2.3序列测定、同源性分析将含有目的片段的PCR产物送至上海生工进行测序分析。测序结果经过整理、拼接，获得完整的HA基因序列。利用MEGA4及MegAlign软件进行分析。

1.2.4免疫血清的制备将收获的鸡胚尿囊液按油乳剂疫苗的制备方法制备灭活疫苗，检验合格后，经胸肌接种20只21日龄SPF鸡，0.5mL/只，同时设空白对照组。于免疫后2周、4周、6周、8周、12周采血，分离血清，分别保存备用。

2结果

2.1 PCR反应与序列鉴定

病料样品处理后接种9～10日龄SPF鸡胚，在培养的72h内未出现鸡胚死亡，72h后测其尿囊液，HA效价为10log2，并且HA阳性尿囊液的血凝性能够被AIV-H9标准阳性血清所抑制，而不能被抗NDV、EDSV、AIV-H5阳性血清所抑制，表明该分离株为H9亚型AIV。进一步利用H9鉴定引物对分离株HA基因进行扩增，得到与预期大小（约488bp）相符片段（见图1）。同时利用测序引物进行扩增送至上海生工技术公司进行测序，测序结果经BLAST比对分析发现，与其匹配度高的几种序列全部为H9亚型禽流感序列，根据MEGA4及MegAlign软件分析，结果显示该病毒与欧亚BJ亚分支同源性99.8%～95.0%，进一步证实该分离株为H9亚型禽流感。

2.5免疫试验结果

免疫后2周抗体效价上升至10Log2，显著高于国标的6.5log2，免疫后4～5周抗体效价维持在9.6Log2滴度，具有较好的保护力度。随后抗体效价逐渐消减，至免疫后12周抗体效价水平维持在7Log2。

3讨论

1994年，我国分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒后，H9N2亚型禽流感病毒在我国禽类中广泛流行，对养禽业造成了巨大经济损失[4]。鸡群感染H9亚型禽流感后产蛋率下降较明显，所以养殖业对H9亚型禽流感病毒的防控十分重视。本试验通过病毒分离，血清学试验为选用H9疫苗提供依据，同时为防控H9N2亚型禽流感提供新思路。█

参考文献：

[1]于力，于康震，徐宜为.动物传染病学[M].北京：中国农业出版社，1999.

[2]孙泉云，陈琦，夏炉明.H9N2亚型禽流感流行现状[J].动物医学进展，2011（10）： 107-111.

[3]栾栋祖，王淑平，臧金来，等.肉鸡温和型禽流感（H9N2）的防治[J].中国动物检疫，2009，26（8）：53-54.

[4]刘红旗，刘秀梵，张如宽.A型流感病毒蛋白研究进展[J].动物医学进展，2002，23（2）：6-9.