王叶子，张 营，周 琪，干国平，谈仲川，张雁淼

（湖北中医药大学药学院/湖北省中药炮制工程技术研究中心，武汉430065）

复方补气口服液为炙黄芪、人参、菟丝子等10味中药材组成的复方制剂，具有补气固表、补益肝肾的功效。复方中炙黄芪为君药，具有扶正固本的功效，主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类成分，其中黄芪甲苷具有增强机体免疫力、抗病毒等药理作用，常作为黄芪的重要指标成分［1，2］。为提高复方补气口服液质量的可控性和稳定性，保证临床用药安全，本研究参考有关文献［3-9］，采用薄层色谱法（TLC）建立制剂中炙黄芪、人参、菟丝子的鉴别方法，同时采用高效液相-蒸发光散射检测器（HPLCELSD）法建立制剂中黄芪甲苷的含量测定方法，并进行方法学验证，为该制剂的质量控制提供定性定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪；Agilent Technologies 1260 Infinity ELSD检测器；梅特勒-托利多AT十万分之一天平；Sartorius BS210S电子分析天平（万分之一）；AS系列超声波清洗机，220 V/50 Hz，天津市特赛恩斯仪器有限公司；ZF-7三用紫外分析仪，254 nm/365 nm，上海康华生化仪器制造厂；HH-2数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.2 药品与试剂

复方补气口服液（批号为180723、180724、190523，湖北华仁药业提供）、黄芪甲苷对照品（批号110781-201717）、人参对照药材（批号180303）、人参皂苷Rg1对照品（批号180610）、人参皂苷Rb1对照品（批号181021）、人参皂苷Re对照品（批号190105）、金丝桃苷对照品（批号111521-201708）均购自中国食品药品检定研究院。硅胶G，薄层层析用，批号为0190423，青岛海洋化工有限公司；层析用中性Al2O3，批号为F20040304，国药集团化学试剂有限公司；高纯度氮气，由明辉气体有限公司提供；水为纯净水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1）炙黄芪供试品溶液的制备。取本品30 mL，用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，弃去三氯甲烷液，水液用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇，用氨试液洗涤3次，每次20 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加20 mL水溶解，通过D101型大孔树脂柱（柱内径为1.5 cm，柱高为12 cm），用40 mL水洗脱，弃去洗脱液，用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加1 mL甲醇溶解，即得。

对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL的溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按制剂处方和工艺制备缺炙黄芪的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2）人参供试品溶液的制备。取本品50 mL，加二氯甲烷提取3次，每次30 mL，弃去二氯甲烷液，水层加水饱和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液。正丁醇液加氨试液提取2次，每次20 mL，弃去氨试液，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2 mL溶解，注入中性氧化铝柱（100～200目，12 g，内径为10～15 mm），用100 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，即得。

对照药材溶液的制备：取人参对照药材1 g，加50 mL水煎煮30 min，滤过，取滤液，按照供试品溶液制备方法制备，即得。

对照品溶液的制备：取人参皂苷Rb1、Re及Rg1对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合对照品溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按制剂的处方和工艺制备缺人参的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

译文：因为维诺娜的至尊十字架到哈德良长城与到怀特岛距离相等，所以罗马人把该处视为英国的中心。（先因后果）

3）菟丝子供试品溶液的制备。取本品20 mL，加石油醚（60～90℃）30 mL振摇提取，弃去石油醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加5 mL水搅拌溶解，通过已处理好的聚酰胺柱（100～200目，0.6 g，内径约1.2 cm，湿法装柱），用30%乙醇30 mL冲洗，再用70%乙醇20 mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，残渣用0.5 mL甲醇溶解，即得。

对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品，加甲醇制成0.25 mg/mL的溶液，即得。

阴性对照溶液的制备：按制剂的处方和工艺制备缺菟丝子的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

1.3.2 含量测定

1）对照品溶液的制备。精密称取黄芪甲苷对照品5.08 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：精密量取样品50 mL，置于分液漏斗中，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次30 mL，弃去氨液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液：除炙黄芪药味外，按处方比例取其他药材，按照制剂的制备工艺制得黄芪阴性样品。精密量取阴性样品50 mL，按照供试品溶液制备方法同法制备，即得。

2）色谱条件。色谱柱YMC-Triart C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈-水（32∶68），流速1 mL/min，漂移管温度100℃，气体流速1.6 mL/min，柱温25℃。

2 结果与分析

2.1 薄层鉴别

2.1.1 炙黄芪按《中华人民共和国药典》（通则0502法）进行试验［10］。分别吸取上述炙黄芪供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液为展开剂展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光（365 nm）下检视。结果表明，日光下供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上显相同的棕褐色斑点；紫外光灯（365 nm）下显相同的橙黄色荧光斑点，阴性样品无干扰（图1）。

2.1.2 人参分别吸取上述人参供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各3μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，置于展开剂预饱和30 min的展开缸内展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，挥干，在105℃烘至显色斑点清晰，于日光和紫外光灯（365 nm）检视。结果表明，供试品色谱在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性样品无干扰（图2）。

图1 复方补气口服液中炙黄芪的TLC

2.1.3 菟丝子分别吸取上述菟丝子供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各2μL，以条带状点样于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶2）为展开剂展开，取出晾干，喷5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热5 min，立即于紫外灯（365 nm）下检视。结果表明，供试品色谱在与金丝桃苷对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰（图3）。

图3 复方补气口服液中菟丝子的TLC

2.2 方法学考察

2.2.1 系统适用性与专属性试验精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液各10μL，对照品溶液5μL，注入液相色谱仪，记录色谱。结果表明，供试品色谱在与黄芪甲苷对照品色谱主成分峰（20.803 min）相近保留时间处有一对应的成分峰；阴性样品在此保留时间处无色谱峰，即阴性样品无干扰，表明该方法专属性好（图4）。

供试品色谱中，黄芪甲苷峰与相邻成分峰之间完全分离，分离度R=2.53，理论板数按黄芪甲苷峰计算为18 000。取对照品溶液连续进样6次，测得黄芪甲苷峰面积的RSD为0.67%，黄芪甲苷峰保留时间的RSD为0.16%（n=6），表明仪器的精密度较好，系统适用性试验符合要求。

2.2.2 溶液稳定性的考察分别取室温条件下贮存的供试品溶液、对照品溶液于0、3、6、9、12 h进样分析。测得黄芪甲苷峰面积对数值的RSD分别为1.17%、0.68%（n=5），表明供试品溶液和对照品溶液在室温下放置12 h基本稳定。

图4 复方补气口服液专属性试验

2.2.3 精密度取同一批样品，按照“1.3.2”项制备供试品溶液，平行制备6份。精密量取供试品溶液10 mL，对照品溶液5、20μL，进样分析。采用外标两点法对数方程计算6份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD值，即为重复性精密度。

取同一批样品，由不同人员、在不同时间操作分析，按照“1.3.2”项制备供试品溶液，平行制备6份。精密量取供试品溶液10μL，对照品溶液5、20μL，进样分析。计算6份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD值，即为中间精密度，再与重复性试验的6份测定结果一并分析RSD值。结果表明，重复性试验6份供试品溶液中黄芪甲苷平均含量为57.84μg/mL，RSD为4.27%；中间精密度试验6份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD为4.12%。12份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD为4.01%，表明该方法精密度良好。

2.2.4 线性与范围精密称取黄芪甲苷35.06 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀即得对照品储备液。精密量取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置于5个10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线，摇匀，即得5个不同浓度的对照品溶液。精密量取各种浓度的对照品溶液20μL，进样分析。以黄芪甲苷峰面积对数值（Y）为纵坐标，以黄芪甲苷进样质量对数值（X）为横坐标，计算回归方程。所得回归方程为Y=1.673 5X+1.926 3，R2=0.999 2（n=5），表明黄芪甲苷进样质量在1.402～14.024μg进样质量对数值与峰面积对数值具有良好的线性关系。

2.2.5 定量限取对照品溶液，逐渐稀释至对照品溶液色谱中黄芪甲苷峰的信噪比约为10时，测得黄芪甲苷的定量限为0.86μg。

2.2.6 加样回收试验精密量取已知含量的样品25 mL，共6份，置于分液漏斗中，分别精密加入对照品储备液（0.055 92 mg/mL）25 mL，制备加标供试品溶液，测定并计算加样回收率。结果表明，黄芪甲苷的平均回收率为99.40%，RSD为4.15%（n=6），说明该方法准确（表1）。

表1 黄芪甲苷加样回收率试验结果

2.3 样品测定

取3批样品，按“1.3.2”的方法制备供试品溶液，以外标两点法计算黄芪甲苷的含量。结果表明，3批样品的黄芪甲苷含量分别为57.84、55.18、58.76 μg/mL。

3 讨论

试验在方法学考察的同时对方法的耐用性进行研究，包括溶剂的提取次数、漂移管温度、柱温。结果表明，供试品溶液制备时，采用水饱和正丁醇提取3、4、5次，对黄芪甲苷含量测定结果无显著性差异；漂移管温度在75～100℃时，柱温在25～35℃均对黄芪甲苷的含量测定结果无显著影响，但柱温为22℃时，供试品溶液色谱中黄芪甲苷峰分离度小于1.5，表明低柱温不利于被测成分的分离。

本研究建立的TLC法和HPLC法受主客观因素的干扰较小，准确、简便，重复性好，可为该制剂的质量控制提供定性定量检测方法。