曲晓媛 卢强 贾世磊

本文主要研究芹菜素对人脑胶质瘤细胞U87凋亡的影响及机制。方法：应用CCK8法检测细胞增殖抑制率。流式细胞术检测细胞周期。Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达。结果：①芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖。②不同浓度的芹菜素作用24h，G2期细胞所占比例呈下降趋势。③芹菜素处理组的细胞，Bcl-2蛋白的表达量随着芹菜素浓度的增加而降低，Bax蛋白的表达量则随芹菜素浓度的增加而升高。结论：芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖，并可能通过线粒体信号途径诱导其凋亡。

胶质瘤（glioma）是最常见的恶性程度极高的中枢神经系统肿瘤，占颅内恶性肿瘤的78%左右[1]。胶质瘤起源于神经系统胶质细胞和神经元细胞，是一类高度血管化的肿瘤，具有弥漫性浸润性生长、侵袭性强、易复发、难切除、预后差[2，3]等特点， 其中位生存期只有一年左右[4-6]。在全身性恶性肿瘤中，恶性胶质瘤5年病死率紧随胰腺癌和肺癌之后，位居第3位[7，8]。

芹菜素是一种天然的黄酮类化合物[9]，低毒，无诱变性[10]，抗癌谱广，是抗肿瘤药研究的热点之一，但其对胶质瘤的确切作用及机制尚缺乏系统研究。本研究采用芹菜素对人脑胶质瘤细胞系U87进行体外干预，以研究芹菜素对胶质瘤细胞凋亡的影响及机制。

材料与方法

实验细胞系

选择人脑胶质瘤细胞系U87作为研究对象，购于北纳生物有限公司。

主要试剂

芹菜素和RIPA细胞裂解液购于北京索莱宝科技有限公司;DMEM完全培养液（1×）和CCK8法细胞增殖检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗体、GAPDH均为美国CST公司产品;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG为上海碧云天生物技术有限公司产品;PVDF膜为Millipore公司产品。

方法

芹菜素工作液的制备  原芹菜素浓度是10mmol/mL，需配制成20umol/L、40umol/L和80umol/L。将原芹菜素稀释1000倍即得到浓度为10umol/mL的芹菜素浓度。依次将2uL、4uL和8uL芹菜素溶解在1mL相应培养基中即可得到所需的实验浓度。

细胞培养  将人脑胶质瘤细胞U87置于含有10%胎牛血清、0.2%NaHCO3、0.3%HEPES 的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2 的恒湿孵箱中进行培养。每天观察细胞生长情况，由于各细胞生长周期不同，每2天换次培养液，3～5天用0.25%的胰酶消化传代一次，取对数生长期细胞（即培养瓶底布满80%时）进行实验。

实验分组  实验共分5组：芹菜素低浓度组（20 umol/L）、芹菜素中浓度组（40 umol/L）、芹菜素高浓度组（80 umol/L）、空白对照组（只加培养基）和阴性对照组（DMSO+培养基）。处理24h后收集所需细胞进行检测。

CCK8法检测芹菜素对U87细胞增殖的影响

对细胞铺板于96孔板贴壁后细胞换液，每孔100ul;每孔加入10ul CCK8试剂，按 20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度梯度设定的芹菜素工作液，分别处理实验组细胞，置于培养箱中孵育2h;酶标仪在450nm波长下，测吸光度（OD）值。同等条件下重复实验三次，计算肿瘤细胞的存活率。肿瘤细胞存活率（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

流式细胞术检测细胞周期

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度芹菜素工作液处理U87细胞，培养24h，胰酶消化，PBS洗涤2次，离心，70%乙醇4℃固定过夜，PBS洗涤2次，离心，碘化丙啶染色，室温避光孵育30分钟。500ul PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞周期变化。

Western-blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L浓度芹菜素工作液处理U87细胞，24h后，收集细胞，3000r/min离心10min后，冰PBS冲洗，加入细胞裂解液，冰上裂解30min后，4℃，10000r/min离心10 min，小心吸取上清，获得总蛋白并测定蛋白浓度。蛋白变性，上样，经十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳1～2h，后湿法转膜30～50min。加入GAPDH一抗（1：1000）、Bcl-2一抗（1：1000）、Bax一抗（1：1000）孵育，4℃过夜;加入山羊抗兔二抗（1：2000）室温孵育1～2h。在膜上滴加电化学发光（ECL）显色液，在凝胶成像系统下成像并测定条带灰度值。

统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件包处理数据。计量数据用均数±标准差（mean±SD）表示。各项参数值之间的比较分别采用t检验和χ2检验，以P <0.05为差异有统计学意义。

结果

芹菜素对胶质瘤细胞U87增殖的影响

CCK8法检测结果显示芹菜素对胶质瘤细胞U87具有增殖抑制作用。与对照组比较，不同浓度的芹菜素工作液处理24h后，细胞生存率下降，细胞生长明显受抑制;并且隨着芹菜素浓度的增高，抑制细胞增殖的效果越明显（图1）。

流式细胞术检测细胞周期结果

分别用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液处理U87细胞24h后，细胞周期各时相所占的比例不相同。随芹菜素浓度的增加，G2期细胞所占比例呈下降趋势。但20umol/L和40umol/L的芹菜素抑制细胞增殖的作用不明显;芹菜素工作浓度增加至80umol/L时，则能明显抑制细胞的增殖（图2）。

凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达

分别用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液处理U87细胞24h后，检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。随芹菜素浓度的增加，Bcl-2蛋白的表达量呈下降趋势，Bax蛋白的表达量呈上升趋势（图3）。

讨论

近年来，天然植物提取物单体以其对正常细胞毒性小，对恶性肿瘤细胞毒性大和促凋亡而备受青睐。

芹菜素，又称芹黄素，是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于自然界中，以植物黄色素的形式在茶叶、蔬菜、水果、豆类和香料中广泛分布，中药如地钱、西藏雪莲花、车前子、络石藤等中也有很高的含量，其中以芹菜根的含量最为丰富，目前已经可以人工合成。通过大量研究发现芹菜素具有抗肿瘤、抗突变、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗焦虑、保护心血管、保护中枢神经等多种生物活性，其中其抗肿瘤作用最为突出，并且与其他黄酮类物质（ 如槲皮素、山奈黄酮等） 相比，具有低毒性及无诱变性等优点[10]。

芹菜素抗肿瘤作用[11-12]的主要机制有：（1）调控细胞周期运行，抑制肿瘤细胞增殖;（2）诱导肿瘤细胞凋亡;（3）干扰肿瘤细胞信号传导;（4）抑制肿瘤血管生成、侵袭和转移。孙悦等[13-14]的研究表明，芹菜素可诱导胃癌细胞凋亡，并且诱导胃癌细胞凋亡的作用呈现药物浓度依赖性，同时证明芹菜素诱导胃癌细胞凋亡的机制主要是通过Bcl-2/Bax-Caspase-3、Caspase-9的线粒体凋亡通路活化实现的。SHUKLA等[15]研究发现，芹菜素可通过诱导前列腺癌细胞周期阻滞于G2/M期，从而有效抑制前列腺癌细胞的增殖，抑制作用表现出现药物浓度依赖性。

本研究中，CKK8法检测结果显示，芹菜素能抑制胶质瘤细胞U87的增殖;并且随着芹菜素浓度的增加，对瘤细胞增殖抑制的作用也越明显，与贡伟一等[16]的研究结果一致。流式细胞术检测细胞周期的结果显示，高浓度的芹菜素可明显减少胶质瘤细胞G2期的细胞数目，提示芹菜素可调控细胞周期的运行，从而抑制肿瘤细胞的增殖能力。在随后进行的凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达的研究中，我们的结果显示芹菜素能够上调Bax蛋白的表达，而Bcl-2蛋白的表达则降低;并且随着芹菜素浓度的增加，Bax蛋白的表达量呈上升趋势，Bcl-2蛋白的表达量则呈下降趋势，提示芹菜素可通过调控凋亡基因、调节参与凋亡的蛋白的表达等方式诱导肿瘤细胞凋亡。此外，不同浓度的芹菜素处理胶质瘤细胞24h后，Bcl-2/Bax比值逐渐降低，我们推测芹菜素可能是通过降低Bcl-2/Bax比值，诱导线粒体依赖的凋亡途径，从而实现其诱导胶质瘤细胞的目的。

综上所述，本研究通过研究芹菜素对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响，探讨芹菜素抗胶质瘤作用的可能机制，以期为中西医结合治疗胶质瘤提供新的思路和方法。

参考文献

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作者简介：曲晓媛 硕士，副教授。研究方向：肿瘤病理学。

基金项目：山东省中医药科技发展计划项目“芹菜素对人脑胶质瘤细胞U87、U251体外抗肿瘤作用的实验研究”（编号：2015-200）。

1.山东中医药高等专科学校免病教研室

2.山东省烟台护士学校临床教学部