李 芹，穆树荷，韩 刚，刘 欢，吴立冬，许玉艳，李晋成

（1中国水产科学研究院，北京100141；2农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京100141；3上海海洋大学水产与生命学院，上海201306）

0 引言

随着人民生活水平的逐步提高，鲜活鱼虾市场需求增长迅猛。由于产销地域差别显著，因此“南鱼北运”、“北鱼南调”和“东西互运”的现象十分普遍。鱼用镇静剂是一类在水产领域中应用能够抑制水产品中枢神经系统功能的药物[1]，其作用效果快速、成本低、操作简单。水产品使用镇静剂后，部分机体或全部机体新陈代谢会降低。镇静剂在水产品运输、繁育和手术等环节使用，可显著降低应激反应提高成活率[2-3]。近几年，媒体多次曝光鲜活水产品在运输、暂养等环节存在镇静剂滥用的问题并引起社会各界广泛关注，对鱼用镇静剂的检测方法研究已受到研究人员的高度重视[4]，梳理现有的水产品镇静剂残留检测方法对我国镇静剂监管具有重要参考意义。

水产品中存在的高水平含量的干扰物质（蛋白质、脂肪、磷脂）可能会妨碍目标分析物的准确分析并导致其回收率偏低。样品制备是从复杂样品基质中提取、纯化、分离和浓缩目标分析物的过程。有效的样品制备方法可以降低提取物中干扰物质的含量，提高检测准确度。合适的样品制备方法已成为准确分析水产品中镇静剂残留水平的关键步骤，目前研究人员开发出了固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)、分子印迹技术(Molecular imprinting technology, MIT)以 及QuEChERS(Quick easy cheap effective rugged and safe)方法。高选择性仪器是精准分析水产品中镇静剂的另一个关键因素，为了满足水产品中镇静剂残留水平的准确定量需求，高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)[5]、高效液相色谱-串联质谱(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)[6]和气相色谱-串联质谱[7](Gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)在其残留检测中受到了广泛应用。

本文对2007—2019年已报道的样品制备和测定方法的优点和局限性进行概述。通过对现有样品制备策略、色谱/色谱-质谱的先进检测技术的比较分析，提出其研究前景，以期为中国鱼用镇静剂的合理使用和管理提供一些信息和借鉴。

1 水产品中镇静剂类型及使用规定

目前，世界上部分发达国家允许在水产领域中使用的鱼用镇静剂包括MS-222、苯佐卡因、丁香酚和异丁香酚，其休药期和最大残留限量(MRL)详见表1。然而，国内缺乏对鱼用镇静剂在水产品中使用的相关规定和监管措施。目前仅有农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》[8]规定，地西泮可以用于食品动物，但不得检出兽药残留；另外，我国将地西泮列为第二类精神药品，参照《麻醉药品和精神药品管理条例》（国务院令第442号）规定，第二类精神药品零售企业应当凭执业医师出具的处方，按规定剂量销售第二类精神药品，并将处方保存2年备查，禁止超剂量或者无处方销售第二类精神药品，不得向未成年人销售第二类精神药品；农业部176号[9]和235号[10]公告禁止在动物饲料中使用氯丙嗪，在动物源食品中不得检出。

表1 部分发达国家水产领域允许使用的镇静剂

2 样品前处理技术

由于水产品具有基质复杂、干扰物质多等特点，合理的样品前处理是水产品中镇静剂残留准确测定的关键[17]，如SPE、SPME、MIT和QuEChERS等样品前处理技术。

2.1 固相萃取技术(SPE)

SPE技术灵敏度高、稳定性好，是目前水产品中采用最多的样品前处理技术[18]。由于镇静剂多为弱极性有机化合物，因此水产品中镇静剂残留分析中应用最多的是反相SPE柱，如C18柱、苯基柱、HLB柱等。

C18柱使用方便，经萃取净化后可以采用多种检测仪器进行测定，因此被广泛使用。Li等[11,19]将水产品中丁香酚经乙腈提取后采用C18固相萃取净化，先后建立基于外标法和同位素稀释法的GC-MS/MS分析方法。Scherpenisse等[20]、朱敏等[21]采用C18柱萃取纯化水产基质中的MS-222，建立了水产品中MS-222的HPLC-MS/MS检测方法。高平等[22]利用C18柱建立了水产品中4种丁香酚类镇静剂残留的HPLC检测方法。

Meinertz等[23]采用苯基(Phenyl)固相萃取净化水产品提取液，建立了水产品中丁香酚的液相色谱检测方法。Ke等[24]采用苯基柱净化，建立了水产品中3种丁香酚类镇静剂的GC-MS/MS检测方法，定量限分别为0.4、1.2 μg/kg和0.2 μg/kg。

赵东豪等[25]采用HLB柱净化，建立了水产品中丁香酚的HPLC-MS/MS检测方法。于慧娟等[26-27]进一步采用含有1%氨水的乙酸乙酯提取水产品中的地西泮及其代谢物（奥沙西泮、替马西泮和去甲西泮），然后经HLB柱净化，同位素稀释方法定量，构建了水产品中地西及其代谢物的HPLC-MS/MS检测方法，4种镇静剂的定量限均为1.0 μg/kg。

固相萃取技术具有样品净化效果好及回收率高的优点，缺点在于批次间的重复性难以保证。

2.2 固相微萃取技术(SPME)

SPME是一种利用表面有机物固定相选择性吸附浓缩目标化合物，然后解吸附的样品前处理技术。解析过程随SPME后续分离手段不同而不同，对于气相色谱(GC)是通过萃取纤维插入进样口后进行热解析，而对于液相色谱(LC)则是通过溶剂进行洗脱。

Huang等[28]在纤维表面修饰一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定相，采用直接萃取微萃取模式，萃取鱼糜基质中的2-苯氧基乙醇、MS-222、丁香酚、异丁香酚和苯佐卡因等5种镇静剂，并用气相色谱四级杆质谱联用仪进行检测，建立的方法最低检测限分别为30、0.5、2.5、14、6 μg/kg。

固相微萃取技术集采样浓缩于一体，克服了传统样品前处理技术的缺点，其高效、快速、简便的优点已经得到人们的共识。由于SPME技术成本高，对多组分化合物存在样品吸附竞争等问题，因此在水产品检测中还未受到广泛应用。目前主要用于食品风味分析[29]。

2.3 分子印迹技术(MIT)

MIT是一种通过在吸附材料表面构筑对目标分子具有选择性识别功能的“空穴”，达到对目标分子选择性吸附浓缩，然后解吸附进行分析的样品前处理技术[30-33]。Sun等[34]利用苯佐卡因为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，采用悬浮聚合法得到平均粒径10～20 μm的吸附材料，填充后制得分子印迹SPE柱，构建了水产品中苯佐卡因的HPLC分析方法，回收率为89.82%～91.94%。Seyed Mosayeb等[35]以MIP为填料，利用填充注射器(MEPS)进行微萃取，戊卡因为模板分子。利用MIP-MEPS和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对利多卡因进行了测定，相关系数值大于0.999。Yang等[36]采用循环伏安法在石墨烯-碳纳米管复合材料(GN-CNTs-IL)上制备了多孔分子印迹共聚物膜，丁香酚为模板分子，电解质为高氯酸四丁基铵乙醇溶液。该方法选择性及重现性好，实用性强，已成功应用于实际样品中丁香酚的检测。

虽然MIT技术具有方便快捷、选择性好，回收率高等优点，但是仍然存在着很多问题：模板不能够完全洗脱，即使反复使用有机溶剂冲洗依旧不能洗脱聚合物内部的模板分子，从而影响其分离和纯化过程[37-38]。

2.4 QuEChERS技术

自Anastassiades等[39]于2003年提出QuEChERS技术以来，其凭借简单、高效等优点，在复杂基质样品前处理方面得到了长足的发展，目前已经被应用到水产品镇静剂检测的前处理过程中。

Li等[40]利用QuEChERS和HPLC-MS/MS联用技术建立了水产中MS-222残留的检测方法，回收率为79.6%～119.7%，定量限为10.0 μg/kg；高平等[41]建立了QuEChERS结合SPE-HPLC同时测定水产品中6种卡因类镇静剂的检测方法。该方法回收率在71.8%～95.3%之间，定量限为0.2 mg/kg。邹游等[42]采用同位素内标法定量，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同时测定猪肉、鱼肉、肝脏和肾脏中氯丙嗪、地西泮和安眠酮残留量的分析方法，加标回收率为92.5%～117.8%。2016年，潘灿平[43]发明一种过滤性净化柱(multiplug filtration cleanup,m-PFC)，他们将QuEChERS技术中分散固相萃取步骤中的吸附剂装填至固相萃取柱管内进行样品处理以达到净化提取液的目的并利用该技术建立了水产品中MS-222的HPLC-MS/MS检测方法。方法的回收率为83.7%～95.6%，定量限为5.0 μg/kg。2019年，Xie等[44]基于有机合成方法合成了MS-222的稳定同位素标记物间氨基苯甲酸乙酯-D5，并将其作为同位素内标，构建了基于QuEChERS净化的水产品中MS-222的同位素稀释-HPLC-MS/MS分析方法，方法的回收率为92.08%～97.50%，定量限为4.0 μg/kg。另外，Li等[45]还设计合成了甲基丁香酚-D3，并构建了水产品中甲基丁香酚的同位素稀释-QuEChERS-GC-MS/MS分析方法，解决了甲基丁香酚同位素标记内标物缺失的问题，提高了分析精度。除了提高QuEChERS方法的分析精度外，发展更加简便的QuEChERS净化方法是另外一个趋势。中国水产科学研究院李晋成等[46]构建了一种活塞式QuEChERS净化柱。他们将净化填料放置到注射器底部，并且在净化填料层的上方和下方均设有多孔筛板，该净化柱只需通过推拉活塞就可以实现待净化提取液与净化填料之间的固液混合和固液分离。该课题组[47]最近在净化柱上端侧壁上设置了一个加样孔，在活塞式QuEChERS净化柱基础上提出了一种可直接从加样孔上样的推杆式滤过型净化柱，并将其应用到水产品中MS-222的快速样品前处理中，效果良好。在活塞式QuEChERS净化柱基础上，该课题组又提出了一种全自动震荡提取净化装置[48]，以期实现高通量自动化QuEChERS前处理，目前正在开展样机的研制工作。

目前，在水产基质样品前处理方面，除了以上提及的几种常用方法外，研究人员还开发出来了漂浮-固化分散液微萃取(floating organic droplet,DLLMESFO)[49]方法。总体而言，SPE和QuEChERS技术凭借其较高的灵敏度和简便的操作过程，是应用最多的前处理方法。

3 检测方法

为了满足水产品中镇静剂残留相关研究的需要，确定水产品体内镇静剂残留浓度水平，研究人员开发出 HPLC[34]、GC-MS/MS[8]和 HPLC-MS/MS[25]等多种镇静剂检测技术。

3.1 HPLC检测方法

HPLC常用的检测器为紫外可见吸收检测器(Ultraviolet-Visible Detector,UVD)和荧光检测器(Fluorescence Detector,FD)。由于常见镇静剂均具有苯环结构，这两种检测器在水产品中镇静剂残留的HPLC分析方法中均有报道。高平等[22]采用中性氧化铝和C18固相萃取柱(Solid-phase extraction,SPE)净化水产品提取液，基于HPLC-FD分析，建立了水产品中4种丁香酚类镇静剂（丁香酚、异丁香酚、甲基丁香酚、甲基异丁香酚）残留的HPLC检测方法。检出限为3.0～6.0 μg/kg，定量限为10.0～20.0 μg/kg，加标回收率为74.7%～103.0%。黄武等[50]利用高效液相色谱法测定了罗非鱼中丁香酚残留量，加标回收率为80.5%～101.2%，检出限为0.03 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg。Sun等[34]报道了用分子印迹技术(Molecular imprinting technique,MIT)净化水产品中苯佐卡因残留，构建了水产品中苯佐卡因的HPLC-紫外检测器分析方法，回收率为89.82%～91.94%。

3.2 HPLC-MS/MS检测方法

高效液相色谱法准确度高，分离范围广，对化合物的结构破坏性小。质谱法灵敏度高，对化合物的结构分析定性十分准确，对标准样品要求也比较低，因此色谱-质谱联用法在分析过程中被广泛采用。

赵东豪等[25]采用HLB SPE柱净化水产品提取液，建立了基于同位素稀释校正的水产品中丁香酚的HPLC-MS/MS检测方法。Scherpenisse等[20]、朱敏等[21]采用C18SPE柱净化水产品提取液，建立了水产品中MS-222的HPLC-MS/MS检测方法。于慧娟等[27]构建了基于同位素稀释校正方法的水产品中氯丙嗪的HPLC-MS/MS检测方法，方法的定量限为1.0 μg/kg。还构建了基于同位素稀释校正方法的水产品中地西泮及其代谢物（奥沙西泮、替马西泮、去甲西泮）的HPLC-MS/MS检测方法[26]，四种镇静剂的定量限均为1.0 μg/kg。储成群[51]等采用HPLC-MS/MS技术快速测定黄颡鱼/桂花鱼中MS-222的残留，方法回收率为77.8%～95.8%，精密度为3.4%～5.2%。该方法为MS-222的残留测定提供了参考依据。

3.3 GC-MS/MS检测方法

Li等先后发展了基于外标法[11]和同位素稀释法[45]的水产品中丁香酚的GC-MS/MS分析方法。Ke等[24]利用SPE-GC-MS/MS法实现了水产品中三种丁香酚类镇静剂（丁香酚、异丁香酚和甲基丁香酚）的检测，定量限分别为0.4、1.2、0.2 μg/kg。Huang等[28]在纤维表面修饰一层聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定相得到固相微萃取柱(Solid-phase micro-extraction,SPME)，建立了基于直接萃取微萃取的水产品中2-苯氧基乙醇、MS-222、丁香酚、异丁香酚和苯佐卡因5种镇静剂气相色谱四级杆质谱联用仪检测方法，方法检测限分别为30、0.5、2.5、14 μg/kg和6 μg/kg。陈焕[52]等人建立了同时检测水产品中6种丁香酚类麻醉剂残留量的气相色谱-质谱(GC-MS)检测方法，该方法对丁香酚类化合物检测标准的制定具有一定的参考价值。

目前，在水产品中镇静剂残留的检测方法中，HPLC-MS/MS或GC-MS/MS凭借其灵敏度高、抗基质干扰性强和准确性高等优点受到广泛应用。然而由于基质效应明显，除开发行之有效的样品制备方法之外，合理内标物特别是同位素内标物的选择是降低基质效应的另一个有效手段，Li等最近基于有机合成方法先后合成了MS-222的稳定同位素标记物间氨基苯甲酸乙酯-D5[44]和甲基丁香酚同位素标记物甲基丁香酚-D3[45]，并将其应用于消除色谱质谱检测过程中基质效应，取得很好的实验效果。

4 结论与展望

随着国家“水产养殖业绿色发展”的理念的提出，绿色兴渔、质量兴渔已经成为共识。但发展现代渔业，保证水产品在市场流通中的品质，合理并规范的使用镇静剂是其中重要的一环。高效、简便的检测技术可为其科学使用和监管提供重要技术支撑。在未来的研究中，应着重进行以下研究：逐步完善和健全镇静剂使用的相关法律法规，建立允许使用的鱼用镇静剂的目录及使用标准；合理的样品前处理方法是水产品中镇静剂残留准确测定方法研究的核心内容。目前仅有超声辅助萃取、固相萃取、固相微萃取、分子印迹技术等前处理技术的应用报道。未来可以开发新型吸附材料及净化方式，如活塞式QuEChERS净化柱和推杆式滤过型净化柱，进而发展自动样品前处理技术，缩短前处理流程和时间，实现高效前处理。