孙家佳 杜亚飞 包瑞敏 张智 杨可心 魏罡

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

松仁当中含有丰富的营养物质，其中包括蛋白质、脂肪酸、氨基酸、脂肪、维生素、矿物质元素及其他的生物活性物质[1]，松仁肽是由松仁蛋白在酶的作用下水解得到的小分子肽链[2-4]。为了克服松仁蛋白在营养方面的弱点，提供极易消化吸收的多肽化合物，有研究采用微生物法发酵松仁肽，利用微生物通过自身的生理功能将松仁蛋白转化为小分子的多肽，该法所得到的松仁肽更易于机体吸收，并且成本低，苦味少，为多肽的制备提供了新的参考[5-7]。

锌是人体所须的营养素，是人体上百种酶的组成元素，参与多种生理功能。锌对儿童和老人的身体健康十分重要，缺锌会使婴幼儿生长发育缓慢、智力发育不良、免疫功能下降等[8-9]。所以，相应的Zn2+在食品方面的研究也越来越受到重视。

肽锌螯合物是当前普遍研究的新型营养补充剂，螯合的概念是指一分子或两分子的官能团与金属离子之间，通过配位作用生成环状构造的化学反应，螯合作用在食品应用方面具有重要的意义[10-11]，人体摄取一些无机微量金属元素的消化吸收效率较低，一般在2%～10%，营养物质的利用价值较低。但一些金属微量元素与氨基酸结合形成螯状化合物时，人体对其的消化吸收的效率大大提高，是未螯合之前的2～10倍，所以螯合物在食品方面起着重要的作用，对于一些营养物质的吸收，可以提供较好的方式，提高营养的吸收率[12-14]。本研究主要对相同条件下制备得到的松仁肽与其Zn2+螯合物进行分离纯化，并以抗氧化能力作为评价标准，进行结构表征的分析与对比。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

松仁粕(市售)；葡聚糖凝胶Sephadex G-50、葡聚糖凝胶Sephadex G-15、DPPH、ABTS，上海源叶生物科技有限公司；三氯乙酸(分析纯)、浓硫酸(分析纯)、三氯化铁(分析纯)、铁氰化钾、硫酸亚铁，天津市光复精细化工研究所；水杨酸，天津市天力化学试剂有限公司。

YXQG02手提式压力蒸汽灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；JA2003型电子天平，海精科仪器有限公司；DHP-9272型电热恒温培养箱，海一恒科技有限公司；DL-6M离心机，湖南星科科学仪器有限公司。

1.2 松仁肽-锌螯合物及松仁肽的制备

松仁肽-锌螯合物的制备：取适量的松仁用粉碎机粉碎，过筛(60目筛子)，将得到的松仁粉末粕经索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液体培养基，加入0.6 g的ZnSO4，用蒸馏水配置成质量分数为12%的悬浊液，枯草芽孢杆菌的接种量为3%，在温度为36 ℃，160转/min的摇床中发酵52 h。高温灭菌后，待冷却，离心取上层清液，冷冻干燥得到粗制松仁肽-锌螯合物(备用)。

松仁肽的制备：取适量的松仁用粉碎机粉碎，过筛(60目筛子)，将得到的松仁粉末粕经索氏提取法，除去松仁粕中的油脂。以松仁粕制作液体培养基，用蒸馏水配置成质量分数为12%的悬浊液，枯草芽孢杆菌的接种量为3%，在温度为36 ℃，160转/min的摇床中发酵52 h。高温灭菌后，待冷却，离心取上层清液，冷冻干燥得到粗制松仁肽(备用)。

1.3 超滤

将去离子水加热至50～60 ℃后清洗超滤组件；在原料液储槽中加入一定量的备用处理后的松仁肽或松仁肽-锌螯合物后，打开低压料液泵回流阀和低压料液泵出口阀，打开超滤料液进口阀、超滤清液出口阀和浓液出口阀，使整个回路通畅。用截留相对分子质量10 000的中空纤维柱低温过滤。在测量过程中记录滤前体积、滤后体积，计算滤液回收率。

滤液回收率=(Vi/V)×100%。

式中：Vi为滤后体积(mL)；V为滤前体积(mL)。

1.4 葡聚糖凝胶Sephadex G-50一级分离

选定合适的层析柱型号(1.6 cm×20 cm)，将干胶颗粒倒入烧杯并加入5～10倍量的蒸馏水，加热溶胀，沸水浴中2～3 h即可使其凝胶充分溶胀。

凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，用去离子水清洗；层析柱循环流淌15 min，与此同时在向装有葡聚糖凝胶Sephadex G-50中加入1/3容积的洗脱液(去离子水)，用玻璃棒搅拌使其成为悬浊液。将葡聚糖凝胶悬浊液加入已清洗好的层析柱，缓慢加入使其均匀填充[15]。

加样：用吸管吸去凝胶柱床顶部大部分液体，小心地把经超滤处理后的松仁肽与松仁肽-锌螯合物加入柱床表面，使其呈一均匀薄层。

洗脱与收集：以蒸馏水为洗脱液，控制流速为0.5 mL/min，样品质量浓度为20 g/L(用冷冻干燥后的固体样品配置)，用小型试管收集，每管收集2 mL，于220 nm波长下测定吸光值。

对于出现的吸收峰，进行体外抗氧化能力比较，分别测试清除羟自由基、总还原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4个指标，选出抗氧化能力最强的进行二级分离。

1.5 葡聚糖凝胶Sephadex G-15二级分离

在一级处理的前提下，对经过一级分离后的松仁肽及松仁肽-锌螯合物进行二级分离，葡聚糖凝胶Sephadex G-15的前处理方式、装柱及加样的实验方式与1.4的实验方式相同。

1.6 抗氧化指标的测定

羟自由基的测定。H2O2与亚铁离子生成·OH，·OH自由基具有较高的反应活性，因为存活时间较短，加入水杨酸，会与·OH自由基反应生产紫色络合物，该有色络合物在510 nm处有较大的吸收波长，吸光度与·OH自由基的量成正比[16-17]。反应体系中含有9 mmol/L乙醇-水杨酸溶液、9 mmol/L硫酸亚、8.8 mmol/L H2O2。比色管中依次加入硫酸亚铁、水杨酸、去离子水，最后加入H2O2，摇匀，在37 ℃条件下反应30 min，以蒸馏水归零，在510 nm的波长下测吸光度[18-19]。

式中：A0为空白对照组的吸光度；AX为加入样品后的吸光度；AX0为不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度。

还原力的测定。取1 mL不同质量浓度的3种待测样品溶液，分别与pH为6.6、浓度为0.2 mol/L的2.5 mL的磷酸钠缓冲液和2.5 mL的铁氰化钾混合，在50 ℃保温30 min后迅速冷却；再加入2.5 mL三氯乙酸后离心3 000 r/min，10 min后取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL氯化铁溶液，混合均匀[20]。反应10 min后在700 nm波长下测吸光度，比较3种被测样品的还原能力，吸光度越大说明还原能力越强[21]。

DPPH自由基清除率的测定。取DPPH 3.5 mg，用无水乙醇溶解，转入10 mL容量瓶，用无水乙醇定容至刻度。取2 mL至100 mL的容量瓶中，摇匀得浓度为0.017 8 mmol/L DPPH储备液备用。用乙醇将松仁肽-锌的螯合物稀释一定浓度，待测。在10 mL比色管中一次加入4 mL DPPH和螯合物的稀释液，加入乙醇至刻度，混均匀立即在517 nm的波长下测吸光值[22]记为Ai。将待测液在室温避光的条件下保存30 min后测吸光值，记为Aj。对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，测吸光值为Ac，按下式计算自由基清除率(K)[23]。

ABTS清除自由基的测定。取0.4 mL ABTS工作液，用PBS溶液稀释备用，2 mL的ABTS溶液分别与松仁肽、松仁肽-锌螯合物混合，常温避光下静止6 nim，在734 nm波长处测定不同吸收峰的吸光度，并记录下来，计算清除率。

式中：A0为不加样品时ABTS溶液的吸光度；A1为加样品后所测得的吸光度。

1.7 结构表征的测定

氨基酸组成的测定。将纯化后的松仁肽与松仁肽-锌螯合的样品冷冻干燥后备用，以固体的形式用氨基酸自动分析仪测定氨基酸的组成。

紫外扫描光谱的测定。用去离子水将松仁肽及松仁肽-锌螯合物分别配制成质量浓度为0.1 mg/mL溶液，采用全自动紫外扫描仪分别进行全波长扫描，扫描范围200～400 nm，分析小肽进行螯合反应前后其吸光度的变化情况，以去离子水作为空白调零。

傅里叶红外光谱的测定。分别取肽与肽锌螯合物固体样品2 mg及干燥后的KBr 200 mg，放入玛瑙研钵中混合研磨，研磨至粒度在2.5～2.0 μm，装入压片装置中，加压至20 MPa，维持1～2 min；取出压片，呈半透明状。利用傅里叶变换红外光谱仪进行定性分析，得到光谱，波长范围500～4 000 cm-1。

能谱的测定。分别将肽与肽锌螯合物粉末用双面胶粘贴于铝制样品台上，然后喷涂一薄层金膜，用能谱仪测定各元素的组成和所占的百分比。

2 结果与分析

2.1 超滤结果

用截留相对分子质量10 000的中空纤维柱低温过滤、截留后，相对得分子质量10 000左右的滤液。所得松仁肽和松仁肽-锌螯合物滤液回收率为87.4%和83.7%。

2.2 松仁肽的分离纯化

2.2.1 松仁肽Sephadex G-50一级分离结果

利用Sephadex G-50凝胶柱可将松仁肽初分为4个组分，分别命名为P-1、P-2、P-3、P-4，其中P-1、P-2、P-3主要是分子量较大的部分，估计主要由枯草芽孢杆菌产生的蛋白酶及未充分水解的蛋白质组成；P-4主要是水解后的短肽。P-4后还有一部分组分具有吸收值，这部分对应于相对分子质量最小的部分，估计主要是游离氨基酸或小分子盐类物质，不予保留。由表1可知抗氧化能力最强的部分为P-4，选其进行下一步实验。

图1 松仁肽一级分离洗脱曲线

表1 组分P-1、P-2、P-3、P-4抗氧化能力测定结果

2.2.2 松仁肽Sephadex G-15二级分离结果

利用Sephadex G-15可将P-4分成3个组分，分别为P-4-1、P-4-2、P-4-3，烘干后分别配制质量浓度为0.5 mg/mL的各组分溶液，测其抗氧化能力。由表2可知P-4-3的抗氧化活性明显高于其他组，择优选取抗氧化能力最强的组分P-4-3进行下一步的结构分析和氨基酸组成分析实验。

图2 松仁肽二级分离洗脱曲线

表2 组分P-4-1、P-4-2、P-4-3、抗氧化能力的测定

2.3 松仁肽-锌螯合物的分离纯化

2.3.1松仁肽-锌螯合物Sephadex G-50一级分离结果

螯合物的洗脱图3中同样出现3个吸收峰，分别记作P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3的3个组分。同样P-Zn-1、P-Zn-2为相对分子质量较大的物质，推测为草芽孢杆菌产生的蛋白酶、未充分水解的蛋白质及其螯合物；P-Zn-3为水解后短肽的螯合物。通过抗氧化能力的比较得出P-Zn-3的抗氧化能力最强，选择P-Zn-3进行下一步的分离。

图3 松仁肽-锌螯合物的一级分离洗脱曲线

表3 组分P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3抗氧化能力的测定

2.3.2松仁肽-锌螯合物的Sephadex G-15二级分离结果

经过Sephadex G-15的P-Zn-3可得到3个组分，分别为P-Zn-3-1、P-Zn-3-2和P-Zn-3-3，其中P-Zn-3-3表现出较强的抗氧化能力。虽然各组分都是多肽分子，但相对分子质量、结构组成不同及某些氨基酸的位置数量不同均对抗氧化活性有影响，需进一步的实验验证。

P-4-1和P-Zn-3-1两者的4项体外抗氧化指标比较可以得出P-Zn-3-1的抗氧化能力高于P-4-1，因此选择P-4-1、P-Zn-3-3组分进行下一步的结构分析和氨基酸组成分析试验。

图4 松仁肽-锌螯合物的二级分离洗脱曲线

表4 组分P-Zn-3-1、P-Zn-3-2、P-Zn-3-3抗氧化能力的测定

2.4 松仁肽与松仁肽-锌螯合物的结构表征对比

2.4.1 氨基酸组成对比

表5为松仁肽与松仁肽-锌螯合物中氨基酸质量分数比较，可知松仁肽与锌发生螯合反应后，苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸和脯氨酸的质量分数均减少，其他11种氨基酸质量分数均有不同程度的增加。其中天冬氨酸和谷氨酸的质量分数增加幅度较大，天冬氨酸的质量分数由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的质量分数由14.953%上升到16.076%，且这两种氨基酸在螯合物中所占比例最高。以上分析表明，酸性氨基酸质量分数高的多肽更容易与Zn2+发生螯合反应，同时也说明了酸性氨基酸与Zn2+的结合能力更强。

2.4.2 紫外扫描光谱分析

肽与肽锌螯合物溶液在200～400 nm波长范围内的扫描曲线如图5所示。可以看出，肽与肽锌螯合物的紫外吸收光谱发生了明显的改变。肽在220 nm处具有明显的吸收峰，而与Zn2+螯合后，其吸收峰移至240 nm处，发生了红移。肽的最大吸收峰在220 nm左右，这是由肽键上羰基(CO)n→π*电子跃迁引起的；当肽与Zn2+发生螯合反应后，Zn2+与肽中的N、O形成配合键后，影响了肽键上羰基(CO)n→π*电子跃迁，从而使其发生红移。

表5 松仁肽与松仁肽-锌螯合物中氨基酸质量分数比较

由此可知肽与Zn2+之间发生了相互作用，并且生成了一种不同于肽的新化合物。紫外扫描光谱证明了肽与Zn2+发生螯合反应并有螯合物的生成。

图5 松仁肽与松仁肽-锌螯合物的紫外吸收光谱

2.4.3 傅里叶红外光谱分析

如图6所示，两种物质在吸收峰位置和吸收强度方面均发生变化。肽的特征性谱带包括酰胺A带、酰胺B带、酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅲ带，分别位于3 232.11、2 922.592、1 698.979 cm-1和1 400.549～1 422.727 cm-1处。当肽分子与Zn2+离子发生相互作用生成肽锌螯合物时，其相应的酰胺谱带分别移至3 248.985、2 952.965、1 676.802 cm-1和1 391.389～1 430.44 cm-1处。酰胺A带由亚氨基的伸缩振动引起，该位置受N原子和氢键的影响；在谱图中，—NH的吸收峰由3 232.11 cm-1移至3 248.985 cm-1，说明在螯合过程中，肽中的—NH发生了变化，其透射率升高，可能是Zn原子替代了H原子所致。酰胺B带与CH2的非对称性伸缩振动相对应；在谱图中，肽与肽锌螯合物的谱带位置由2 922.592 cm-1移至2 952.965 cm-1，表明CH2基团也参与了螯合反应。酰胺Ⅰ带主要由CO的伸缩振动引起，同时还伴随N—H的弯曲振动、C—N的伸缩振动及CN的变形振动，且谱带波数越低氢键作用力越强；在图谱中，CO的吸收峰由1 698.979 cm-1移至1 676.802 cm-1，故羰基参与了配位螯合反应，反应形成的肽锌螯合物中相邻链间的分子内相互作用力与肽相比明显减弱。酰胺Ⅲ带主要由—COOH的伸缩振动引起，图谱中1 400.549～1 422.727 cm-1移至1 391.389～1 430.44 cm-1，表明—COOH可能结合了锌。

图6 松仁肽与松仁肽-锌螯合物的傅里叶红外光谱图

2.4.4 能谱分析

能谱分析的原理是利用具有一定能量的电子束照射样品，使样品组成当中的原子或分子的电子受激发而发射出来，这些电子具有特征能量，并同时显示表面结构的变化。两种化合物经能谱分析可以看出，松仁肽中含有C、N、O等元素，不含有Zn元素；而松仁肽-锌螯合物中除含有C、N、O元素外，还含有Zn元素，证明了肽锌螯合物中Zn元素的存在。对元素进行定量分析可知，肽锌螯合物Zn元素质量百分比为2.86%。能谱分析进一步证明了螯合反应的发生。

表6 松仁肽各元素占比 %

3 结论

松仁肽与松仁肽-锌螯合物经过超滤、Sephadex G-50一级凝胶过滤层析分离得到P-1、P-2、P-3、P-4等4个组分及P-Zn-1、P-Zn-2、P-Zn-3等3个组分，分别测试清除羟自由基、总还原能力、ABTS自由清除率和DPPH自由基清除率等4个指标，得出P-4和P-Zn-3组分的抗氧化能力较强，并对该组分进行Sephadex G-15二级分离，抗氧化能力比较后得出P-4-1、P-Zn-3-1的能力强。

图7 松仁肽的能谱分析图

表7 松仁肽-锌螯合物各元素占比%

图8 松仁肽-锌螯合物的能谱分析图

对P-4-1和P-Zn-3-1进行氨基酸组成、紫外扫描光谱、傅里叶红外光谱和能谱的测定，松仁肽与松仁肽-锌螯合物的氨基酸组成分析可得出氨基酸质量分数在螯合前后有所变化。其中天冬氨酸的质量分数由6.306%上升至12.083%，谷氨酸的质量分数由14.953%上升到16.076%，证明了酸性氨基酸质量分数高的多肽更容易与Zn2+发生螯合反应，同时也说明了酸性氨基酸与Zn2+的结合能力更强。紫外和红外的扫描结果显示出螯合前与螯合后的吸光度、吸收峰和吸收强度均有所变化。在能谱分析中，根据不同元素的能量来辨别不同物质的元素组成，得出的能谱结果显示，螯合前无Zn2+的能量柱，螯合后出现Zn2+。

在对松仁肽与其Zn2+螯合物的分离纯化时，以抗氧化能力作为评价标准，通过不同组分间的比较可看出，与Zn2+螯合后的化合物的抗氧化能力高于未螯合的松仁肽。将得出抗氧化能力最强的组分进行结构测定，得出的结果显示两者的结构表现出明显的变化，说明了有Zn2+参与的螯合反应会对松仁肽的抗氧化能力有所影响。