武帅

摘 要：为了更好的检测人体血清中尿素含量，为临床医学病情诊断提供技术支持，本文提出ILD-LCMS/MS的人体血清尿素含量测定方法。对此，本研究在传统ID-GC/MS检测方法的基础上，结合同位素稀释质谱法对样品数据进行处理，从而保证数据处理的准确性。试验结果表明，该方法的回收率和精密度低，且线性范围和检出限在合理范围内。最后将测定的结果与血清标准物质浓度进行对比，总的相对偏差都低于1%，证实了该方法的可行性。

关键词：血清;尿素;LD-LCMS/MS;同位素稀释质谱法

中图分类号：TQ441 文献标识码：A 文章编号：1001-5922（2021）07-0029-05

Study on the Determination of urea in Human Serum

Wu Shuai

（Clinical Laboratory， Bei qing lu Outpatient Department， Jing bei Medical District，

PLA General Hospital， Bei Jing 100094， China）

Abstract：In order to better detect the urea content in human serum and provide technical support for clinical medicine and disease diagnosis， this paper proposes the ILD-LCMS/MS method for the determination of human serum urea. In this regard， this study is based on the traditional ID-GC/MS detection method， combined with isotope dilution mass spectrometry to process the sample data， so as to ensure the accuracy of data processing. The test results show that the recovery rate and precision of this method are low， and the linear range and detection limit are within a reasonable range. Finally， the results of the determination were coMPared with the concentration of serum standard substances， and the total relative deviation was less than 1%， which confirmed the feasibility of the method.

Key words：serum; urea; LD-LCMS / MS; isotope dilution mass spectrometry

人體的血清中含有多种元素， 医学常用通过检测血清中元素的含量来检查病人身体健康情况。血清中尿素、尿酸及肌酐的测定能够给临床医学、病情诊断提供重要参考。目前用来测定血清中尿素、尿酸及酸酐的方式有很多，但为了检验结果的准确性，确立标准可靠地标准化参考方法。血清中尿素测量的液相色谱-同位素稀释串联质谱法原理可靠、前处理简单且定量准确，是目前血清中尿素测量较为重要的一种候选参考方法，本文通过设置实验，进行实验，验证结果的过称确定此方法的可行性，为血清中尿素标准检验物质提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 设备与试剂

1.1.1 仪器的选择

美国安捷伦公司生产的液相色谱-串联质谱仪6410B;德国梅特勒公司生产的天平ME235S，Max=230g，d=0.01mg;天平METTLERTOLEDOUMX2，Max=2.1g，d=0.1μg;北京医用离心机厂生产的离心机LD5-2A;德国Brand生产的移液器：1000μL、200μL、20μL;美国ScientificIndustries生产的漩涡振荡器VOREX-2GENIE;中国和利生产的超低温冰箱。

1.1.2 血清样品

本次实验选择的血清样品是由军事医学科学院野战输血研究所提供的冰冻混合人体血清。血清标准物质为标准物质SRM909b标准I，人血清干粉，美国NIST。

1.1.3 实验试剂

美国生产的尿素标记物Urea-13c，15N2，纯度99atom%13C，98atom%15N，Sigma;国家标准物质研究中心提供的标准物质：GBW09201，纯度为99.9%，不确实度为0.2%，K=2;德国Merck生产的甲醇：高效液相色谱级、乙腈：高效液相色谱级;实验用水为高纯三次水（Millipore，0.22μm）。

1.2 研究方法

本文采用的研究方法为液相色谱/大气压电离质谱法。目前实验常用方法为气相色谱质谱法，但该方法需要经过复杂的衍生化反映才能进行气相色谱分析。而样品衍生过程分为2个步骤：①将尿素转化为2-羟基嘧啶衍生物，②利用甲基硅烷化作用。但该种方法有个弊端就是尿素衍生物在短时间内不稳定，易分解，可能导致色谱峰拖尾。也就是说该种方法样品前处理过于复杂及费时，故此次实验不采用此种方式。本次实验采用的液相色谱/大气压电离质谱法是基于Tetsuya Tamgawa，Yasuo Mlzo-oku，Kouichi Morlguchi，Takahiko Osumi和Masaaki Odomi建立的。该方法的特点在于直接使用高效液相色谱直接在尿素中定性定量分析，样品前处理简单，且检测结果准确和精密度皆在可接受范围以内。

1.3 实验过程

1.3.1 实验溶液配置及样品预处理

（1）标准溶液配置。尿素标准溶液配置：根据实验所需浓度计算所需尿素标志物质量及水溶液体积（在计算时需考虑标准物质纯度），精准称取实验所需质量精纯尿素标准物质融于标准体积水溶液，通过煮沸后冷却至室温完成配置过程。

尿素标记物标准溶液配置：根据实验所需浓度计算所需尿素标记物13C，15N2质量及水溶液体积（在计算时需考虑标记物纯度），精准称取实验所需质量精纯尿素标记物13C，15N2融于标准体积水溶液，通过煮沸后冷却至室温完成配置过程。

以上标准溶液配置完成以后分装，密封后置于实验用超低温空间中，-20℃的环境保存。

（2）校准比值混合溶液配置。据常规方法测定的血清样品中的大致浓度，用微量移液器将一定体积尿素标记物溶液取出，然后加入到一定体积的尿素标准溶液。使得校准比值溶液中尿素质量与标记物质量比分别为：0.8、0.9、1.1、1.2.配置好校准比值混合溶液后用进度为d=0.01mg的天平称量，并且记录读书，将室温下充分混匀，保持平衡。

（3）血清样品制备。将血清样本从超低温冰箱取出放置，待样本在室温条件下恢复平衡以后，称取一定质量的血清，再称取前需要先轻摇混匀，避免产生气泡造成影响。根据之前测定的血清样本里尿素的大致浓度向样品中加入一定体积的尿素13C，15N2标记溶液，使得溶液中尿素含量与标记物含量比值接近1∶1，将混合后的溶液称量，记录读数，轻摇混匀。

将加入标记物以后的血清样本放置在室温下平衡一个小时左右，在平衡后的溶液中加入一定体积的乙腈试剂，使该溶液里血清为乙腈的1/3。混合均匀，静置沉淀蛋白质。将沉淀后的溶液取上层清液用乙腈稀释，稀释至1μg/g后，用0.22μg/g的有机滤膜过滤，放入2mL样品瓶中，进行ID-LC/MS/MS分析。

1.3.2 数据处理

将样品制备好以后，就可以计算血清浓度了。本文采用的是括号法，括号法的数学模型为图1所示。计算公式为：

式中，c代表血清中尿素质量浓度，单位为μg/g;mpike代表加入血清中的尿素标记物质量，单位为μg;mserum代表血清样品的质量，单位为g;RAS代表样品中尿素与尿素标记物面积比;RAL代表低标中尿素与尿素标记物面积比;RAH代表高标中尿素与尿素标记物的面积比;RML代表低标中尿素与尿素标记物的质量比;Rmh代表高标中尿素与尿素标记物的质量比。

1.3.3 实验环境

（1）沉淀剂用量。在确定样品之前，我们做了多组实验。分别往标记物标准溶液里面加入一定体积的乙腈，使得乙腈与标准溶液里面的血清体积比分别为2∶1、3∶1、4∶1;观察里面的蛋白质沉淀情況。经过对混合溶液的观察分析，当乙腈与血清的体积比为3∶1时，分层明显，上层溶液澄清，能够完全看清蛋白质沉淀。当体积比为2∶1时，溶液呈现浑浊状态，当体积比为4∶1时，沉淀效果变化不大，故最适合用于实验的乙腈与血清体积比例为3∶1。

（2）色谱条件。色谱柱的选择：为了达到最好的实验结果，本次实验开始之前，对比了4种色谱柱，分别是：AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm;AgilentZORBAXSB-Aq2.1×150mm，3.5μm;DikmaInertsilODS-SP2.1×150mm，5μm;VenusilMPC-18100A4.6×150mm，5μm。通过实验对比发现，尿素在AgilentZORBAXRX-SIL4.6×150mm，5μm上保留程度较大，故此次实验选择的是AgilentZORBAXRX-SIL为分析柱。

流动相的选择：为了选择出最适合的流动相，本次实验对比了甲醇/水体系及乙腈/水体系。使用甲醇/水体系时，尿素在色谱柱上保留力度较小（Agilent ZORBAX RX-SIL 2.1×150mm，5μm，有机相/水相=95/5，0.2mL/min，保留时间2.5min）;当使用乙腈/水体系时，尿素在色谱柱上保留力度较大，（Agilent ZORBAX RX-SIL2.1×150mm，5μm，有机相/水相=95/5，0.2mL/min，保留时间6.8min）。

流动相比例的优化：为了得到最适合的流动相比例，本实验分别对比了乙腈/水体积=95/10、95/5、98/2时的状况，实验表明，当乙腈/水体积比为95/5时，尿素与基底物质中的其他物质能够很好的分离，且保留时间比较合适，峰形较好，用来作为流动相正合适。

通过以上3个实验，选择最适合的色谱条件为，色谱柱：Agilent ZORBAX RX-SIL（2.1×150mm，5μm）;流动相：乙腈/水=95/5（V/V）;流速：0.2mL/min;进样量：2μL;色谱柱温度：30℃。

（3）质谱条件。为了得到最适合的质谱条件，在实验开始前，先对质谱进行一定分析。在全扫描（TIC）模式下，寻找分子离子峰。提取离子为尿素m/z61.1，内标m/z。在确定母离子后，选择反应监测（SIM）模式下优化Fragmentor参数，对比Fragmentor在60V、80V、100V、120V时质谱信号的响应，发现在60V时，质谱响应最大，故确定60V为Fragmentor参数。

在子离子扫描（Product Ion）模式下，寻找尿素及内标的子离子，经过对比发现，内标离子分别为44.0、46.0时最适合。质谱碎裂机理为尿素及尿素标记物分子离子与中性碰撞气-氨气碰撞后，分别失去一个氨基，从而得到子离子。

在确定母离子和子离子以后，在多重反应监测（MRM）模式之下发生优化碰撞（Collision Energy，CE），不同CE下质谱响应为表1、表2，通过观察，在CE为20时，质谱响应最大，即将其确定为CE参数。

综合上述实验结果，本实验所用质谱条件为离子源：ESI（+）;数据采集时间为5min;扫描时间为200ms;MRM为m/z=61.1-44.0和64.1-46.0（尿素标记物）;干燥气温度为350℃;干燥气流速：9L /min;Nebulizer为40psi;Fragmentor为60V;CE为20V;Delta EMV为200V。

1.4 分析过程

将4个调试好的校准比值混合溶液以从低到高的顺序进样，为了测量结果的准确，每个校准比值混合溶液需要重复测定3次。将尿素与尿素标记物的面积比值作为此次实验的评定标准。注意，如果所得结果的RSD超过了1%，就需要重新测定。如果尿素与尿素标记物质量笔峰面积比图像曲线的线性回归系数的平方小于0.999，也需要重新测定。

每个血清样品与它的一对标准同一批测定，在分析的时候，以高标、样品、低标、样品、高标、样品、低标次序进样。即每个样品都与其相邻的低标和高标对比校准，这样就能保证结果的RSD在1%以内。将实验所得结果均值作为此次实验的有效数据。

2 结果与分析

2.1 方法的精密度

为了监测此种方法的精密度，本文应用实验方法测定3种不同浓度的血清。将每种浓度、每个批次平均分为3次，进行平行测定。将结果进行统计分析，最后得出结论：该实验RSD值均小于1.0%，具有较好的精密度，如表3所示。

2.2 回收率

本次实验时以低浓度血清为研究对象，在加入一定量的尿素标准溶液 以后，运用该实验方法测定血清尿素浓度，以此研究该方法的回收率和准确性。浓度为1507.466μg/g血清中尿素标准溶液加入量分别为100μL和200μL。将配好的溶液做3个平行样品进行测定，共测定了两批，测定回收率分别为98.0%～102.3%和97.9%～101.1%。如表4所示。

2.3 线性范围和检测限

为了得到最准确的结果，本次实验以尿素与尿素标记物的质量比对峰面积比做回归分析。通过分析结果可知，在100～3000μg/g的范围内，尿素与尿素标记物的质量比与峰面积比呈现良好的线性关系。回归方程为Y=0.881x-0.014，R2为0.99998。

2.4 方法的验证

为了确定此方法的准确性，用该方法检测美国NIST血清标准物质SRM 909b水平I两次，且每次测试都需重复检测4次，测定的结果在标准范围以内，证实了该方法的准确度。

3 定值结果

为了确定该方式在实际生活中的应用，用本文所建立的方式分别对两个水平的人血清中尿素标准物质进行定值。将结果统计如表5、表6所示。

4 结论

文章设立的利用LD-LCMS/MS测定人体血清中尿素含量的方法相对于传统ID_GC/MS法，前处理过程得到了较大简化。利用乙腈/水体系作为流动相，使得尿素在色谱柱上保留时间及保留力度都较强，且不需要缓冲盐，适用于质谱的分析。选择了同位素稀释质谱法能够保证该方法的高准确度与溯源性。在数据处理过程中，选用了括号法矫正质谱仪的波动，保证了数据的准确度。并且利用实验验证回收率及线性范围，将测定结果与国际标准不确定度对比，检测该方法的准确度。最后应用这个方式对两种浓度的血清标准物质进行检测，检测结果与标准结果只偏差0.32%和0.22%。综上分析，建立的血清尿素测定方式相对传统血清检测方式更为简单快速，且定量准确，有望成为检测血清中尿素的参考方法，并且为后续血清尿素标准物质的研究提供支持。

参考文献

[1]戚登斐，张润光，韩海涛，等.核桃油中亚油酸分离纯化技术研究及其降血脂功能评价[J].中国油脂，2019，44（02）：104-108.

[2]张宏康，王中瑗，杨启津，等.同位素稀释质谱法在食品分析中的应用研究进展[J].食品科学，2018，39（23）：280-288.

[3]陶大利，白鹤，李琴.SPE净化-同位素稀释质谱法测定乳与乳制品中生物素的含量[J].现代食品，2018（21）：103-106.

[4]戚登斐，张润光，韩海涛，等.核桃油中亚油酸分离纯化技术研究及其降血脂功能评价[J].中国油脂，2019，44（02）：104-108.

[5]苑萌，刘海忠，任剑锋.幽门螺杆菌、胃蛋白酶原和血清胃泌素-17诊断及鉴别诊断老年胃癌和胃癌前病变的价值研究[J].临床和实验医学杂志，2019，18（04）：376-379.

[6]赵辉，郝淑杰，刘原栋，等. 基准方法及其在標准物质定值中的应用[J].化学分析计量，2018，27（S1）：101-104.

[7]陈静.尿素～（14）  C呼气试验与血清抗体和组织病理学在检测幽门螺杆菌感染中的比较[J].中国社区医师，2019，35（07）：123+126.

[8]张磊，武玉晶，范志娟，等.高效液相色谱-质谱联用定量检测人血清5个溶血磷脂酰胆碱的浓度[J].药物分析杂志，2019，39（02）：272-279.

[9]刘海培，姜小梅，韩文念，等.人体血清中3种脂溶性维生素的液相色谱-串联质谱分析方法研究[J].分析测试学报，2019，38（06）：728-733.

[10]左筠，吴齐红.不同评价标准下心外科人血清蛋白使用合理性比较与分析[J].现代医药卫生，2019，35（14）：2095-2097+2101.