李美 楼姣英 耿韦华 乔晓叶

清毒栓是金哲教授研究多年并在临床上已取得较好疗效的中成药，临床主要用于治疗宫颈炎、宫颈人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)感染、宫颈上皮内瘤变等，并取得了较满意的疗效[1-3]。前期课题研究发现清毒栓含药血清对SiHa细胞体外增殖有明显的抑制作用，可直接抑制SiHa细胞的生长、调节周期、促进凋亡，可能通过对阴道局部免疫微环境的调节作用，起到抗病毒的作用[2]，并可能通过调控PTEN-Mdm2-p53网络环路的分子机制，达到抑制肿瘤的目的[4-5]。本课题体内实验研究发现中药清毒栓灌胃处理可以显著抑制宫颈癌荷瘤小鼠肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，且浓度越高,疗效越显著；清毒栓能够上调干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)水平，降低转化生长因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)和白介素-10(interleukin- 10，IL-10)含量，可能逆转微环境中的免疫抑制[6]，从而具有一定的抗病毒作用。体外研究发现清毒栓通过调节叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Forkhead box P3,Foxp3)影响β-连环蛋白(β-catenin)通路从而抑制SiHa细胞的机制[7]。为进一步探究机理，在前期基础上，本实验以人宫颈癌SiHa细胞为研究对象，观察清毒栓含药血清对SiHa细胞凋亡途径相关基因及蛋白的表达影响，为该药临床应用提供更充足的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞株

清洁级C57BL/6小鼠22只，日龄49天，购自三峡大学实验动物中心，许可证号：SCXX(鄂)，2017-0012。分笼饲养，温度24～26℃，相对湿度50%～60%，通风良好，每日光照12小时，昼夜交替；人宫颈癌SiHa细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 实验药物

清毒栓(专利号：ZL 201010109562.1)，主要组成为紫草、莪术、黄柏等，均购自北京同仁堂药店，将复方药物分别醇提(紫草)、油提(莪术)、水煎(黄柏)，去渣后一副药浓缩至20 mL，终浓度约为4.2 g/mL，高温消毒后于4℃冰箱密封保存。

1.3 主要仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1FD)；电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司，HW-SY11-KP2)；凝胶扫描仪(Beckmancoulter，CytoFLEX)；流式细胞仪(BD Biosciences，FACSCalibur)；PCR扩增仪(北京东胜创新生物科技有限公司，EDC-810)；垂直电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN)；MultiskanMK3酶标仪(Thermo，mμlISKANMK3)等。

1.4 主要试剂

磷酸缓冲盐溶液、胎牛血清FBS(Gibco，16000-044)；改良Eagle培养基(Dulbecco’s modification of Eagle's medium,DMEM)(Gibco，11965118)；lip-2000(ThermoFisher，11668019)；含有苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(南京沃宏，329-98-6)的裂解液(碧云天，P0013B)；样品缓冲液(15 g SDS，15.6 mL 2 M Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL β-mercaptoethanol)；聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(Bio-Rad，162-0177)；GSK126；pGEM-Foxp3(北京义翘神州科技有限公，HG11652-G)；Foxp3抗体(1∶1000，Affinity，BF0630)、EZH2抗体(1∶1000，Affinity AF5150)、G1/S-特异性周期蛋白-D1抗体(1∶1000;Affinity，AF0931)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)抗体(1∶1000，Affinity，AF6311)、c-Myc抗体(1∶1000，Affinity，AF0358)、β-catenin抗体(1∶1000，Affinity，AF6266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体(1∶2500，Abcam，AB9485)；辣根过氧化物酶二抗(Dianova，Hamburg，Germany)；电化学发光显影液(Bio-Rad，170-5060)；八肽胆囊收缩素检测试剂盒(cholecystokinin-8，CCK-8)(七海生物公司，20150520)；琼脂糖凝胶(Biowest，111860)；染色质免疫沉淀检测试剂盒(Beyotime，P2078)。

1.5 含药血清制备

将22只清洁级C57BL/6小鼠随机分为空白组和药物组，每组11只；分别用PBS和中药对两组小鼠进行灌胃，早晚各1次，每次灌胃量为0.4 mL，连续灌胃3天；两组小鼠均于最后1次给药后1～2小时摘眼球取血；将血液静置30分钟后，3000 r/min，离心半径14 cm，离心10分钟，取上清分装到1 mL无菌EP管中，保存至-80℃冰箱备用。用前56℃水浴30分钟，灭活补体。

1.6 细胞培养

将SiHa细胞使用含有10%FBS的DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养，视细胞生长情况用0.25%胰蛋白酶每周传代2次。当细胞稳定并进入对数生长期时开始用于实验。

1.7 细胞分组及给药方法

实验分为6组，EZH2抑制剂GSK126(10 μM)处理1小时后再进行含药血清或对照血清处理，本研究设15%空白血清组，15%含药血清组，15%空白血清+空白溶剂，15%空白血清+GSK126组，15%含药血清+空白溶剂组，15%含药血清+GSK126组。

1.8 染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)+实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法检测Foxp3启动子区组蛋白甲基化水平

实验步骤：交联→解交联→超声打碎→免疫沉淀→洗涤→DNA纯化→PCR检测。将长链的DNA打碎成不同长度的启动子引物序列。结果见表1。取5 μL的PCR扩增产物加入2%琼脂糖凝胶于凝胶扫描仪中电泳检测含药血清处理对Foxp3启动子区组蛋白甲基化水平影响。

表1 Fopx3启动子区引物序列信息

1.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot，WB)检测SiHa细胞EZH2的蛋白表达水平

分别用空白血清和15%含药血清SiHa细胞进行血清培养72小时，之后用含有PMSF的裂解液裂解后测定浓度，配胶完成钠十二烷基的硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)蛋白质电泳，并转移至PVDF膜上，用含0.1% Tween的4%牛奶封闭液，加入EZH2抗体和GAPDH抗体，4℃孵育过夜，洗膜、显影、图像进行3次采集并分别计算目标蛋白与内参GAPDH灰度值的比值。

1.10 qRT-PCR法检测SiHa细胞Foxp3 mRNA的表达水平

根据RNA提取试剂盒RNeasy MiniKit(Qiagen，74106)说明书提取RNA并对DNA酶DNase进行消化(RNase-Free DNase Set，Qiagen，79254)。cDNA合成使用大容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems，4368813)。按照使用手册将预混SYBR Green I荧光染料的样本用qRT-PCR系统(Applied Biosystems，Step One Plus Real-Time PCR)进行qRT-PCR反应。检测Foxp3和的mRNA水平以GAPDH为对照，采用2-ΔΔct方法计算测定3次不同样品中基因的相对表达量。反应条件：qRT-PCR循环参数设定：95℃ 3分钟，95℃ 30秒，62℃ 40秒，共40个循环。结果见表2。

表2 基因引物序列

1.11 WB法检测SiHa细胞Foxp3蛋白以及Foxp3下游信号因子的表达水平

经血清培养后，用WB法分别对15%空白血清+空白溶剂组，15%空白血清+GSK126组，15%含药血清+空白溶剂组，15%含药血清+GSK126组4组细胞中Foxp3蛋白及其下游信号分子β-catenin、c-Myc癌基因、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)蛋白的相对表达量分别进行3次检测，具体检测方法同上。

1.12 CCK-8检测SiHa细胞的活性

取对数生长期SiHa细胞，经胰酶消化、离心、细胞计数后，调整细胞悬液密度为1×105个/mL，接种于规格为96孔的培养板内(150 μL/孔)，24小时以后提取培养完成的贴壁细胞，在两组EZH2抑制剂GSK126(10 μM)处理组及两组空白溶剂组中的两组细胞中再进行含药血清/对照血清处理。过表达质粒组及两组空白质粒组中以150 μL/孔分别加入含药血清和空白血清，各组设5复孔。将培养板置于5% CO2培养箱中孵育72小时后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，混匀，采用Multiskan MK3酶标仪在450 nm双波长处分别测得3次相应的吸光值(OD值)。

1.13 统计学处理

2 结果

2.1 ChIP检测Foxp3蛋白启动子组蛋白甲基化水平

Foxp3启动子-370—-520区域检测出甲基化条带，15%含药血清组与空白血清组相比，该区域甲基化条带明显增宽。结果见图1。

图1 清毒栓含药血清对Foxp3启动子不同序列区组蛋白甲基化水平影响

引物1对应Foxp3-200—-350启动子区域，引物2对应Foxp3-370—-520启动子区域，引物3对应Foxp3-700—-850启动子区域，引物4对应Foxp3-900—-1050启动子区域。结果见图2。

图2 清毒栓含药血清对Foxp3启动子组蛋白甲基化影响

2.2 WB法检测两组细胞中的EZH2表达

15%含药血清组与空白血清组相比，SiHa细胞中EZH2蛋白相对表达量显著增加(P<0.05)。见图3、表3。

注：A：15%空白血清组；B：15%含药血清组。

表3 WB法检测清毒栓含药血清对SiHa细胞EZH2蛋白表达的影响

2.3 CCK-8法检测SiHa细胞的活性

为了说明含药血清诱导的Foxp3表达下调与EZH2有关，采用EZH2抑制剂GSK126，研究其对SiHa细胞凋亡的影响。GSK126造模时间72小时，测OD值。结果显示：15%空白血清+GSK126组与15%空白血清+空白溶剂组相、15%含药血清+GSK126组与15%含药血清+空白溶剂组，OD值显著升高(P<0.05)；15%含药血清+空白溶剂组与15%空白血清+空白溶剂组、15%含药血清+GSK126组与15%空白血清+GSK126组相比，OD值显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 CCK-8检测各处理组SiHa细胞活性

2.4 qRT-PCR检测Foxp3的mRNA的表达水平

分别用15%含药血清处理后，mRNA表达含量明显降低(P<0.05)；GSK126处理后，表达含量明显升高(P<0.05)。且EZH2抑制剂GSK126可以逆转含药血清诱导的Foxp3的mRNA表达降低(P<0.05)。见表5。

表5 WB法检测各组SiHa细胞Foxp3蛋白相对表达含量

2.5 WB法检测SiHa细胞Foxp3蛋白以及Foxp3下游信号因子的相对表达量

分别用15%含药血清处理后，蛋白表达含量明显降低(P<0.05)；GSK126处理后，蛋白含量明显升高(P<0.05)。且EZH2抑制剂GSK126可以逆转含药血清诱导的Foxp3蛋白的表达降低(P<0.05)。见图4、表6。

表6 qRT-PCR法检测各组SiHa细胞Foxp3 mRNA相对表达含量

分别用15%含药血清和GSK126处理Control-15%+solvent组，含药血清处理后，β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量显著降低(P<0.05)，Caspase-3蛋白含量显著增加(P<0.05)；GSK126处理后，β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量显著增加(P<0.05)，Caspase-3蛋白含量显著降低(P<0.05)。EZH2抑制剂GSK126可以逆转含药血清诱导的β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白含量降低及Caspase3蛋白含量增加。见图5、表7。

注：C：15%空白血清+空白溶剂组；D：15%空白血清+GSK126组；E：15%含药血清+空白溶剂组；F：15%含药血清+GSK126组。

注：(1)C：15%空白血清+空白溶剂组；D：15%空白血清+GSK126组；E：15%含药血清+空白溶剂组；F：15%含药血清+GSK126组。

表7 WB法检测各组SiHa细胞Foxp3下游信号因子相对表达含量

3 讨论

宫颈癌是导致全球女性死亡的第二大恶性肿瘤[8]，仅次于乳腺癌，发病率在我国女性生殖道恶性肿瘤中居第一位。临床研究表明，持续的HPV感染是宫颈癌发生的必要因素，此外，宿主细胞基因的遗传和表观遗传学改变对于宫颈癌前病变向浸润性癌症的发展至关重要。根据致病危险性不同，HPV分为高危型和低危型，高危型HPV16、18型是最主要的两种致癌性HPV，分别占宫颈癌发病的55%～60%、10%～15%，其他类型的HPV感染有地域性差异[9-10]。HPV主要通过感染皮肤和宫颈鳞状细胞的基底细胞产生损伤，其中大多数女性体内的HPV会被自身免疫系统清除，并不产生病变，而一部分女性体内的HPV会产生持续性感染，若不予以及时干预，HPV将以环状DNA方式自我复制，随着病情进展整合到宿主细胞DNA中，造成宿主细胞异常分化引发癌变。所以机体免疫力，尤其是宫颈局部免疫微环境对HPV的清除至关重要。表观遗传学改变是指在核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传的变化。DNA甲基化是目前研究最清楚且最重要的表观遗传修饰形式，HPV基因甲基化改变及其对宿主DNA甲基化的影响，在宿主细胞癌变过程中发挥重要作用。局部免疫微环境中的调节性T细胞(regulatory Tcells，Treg)是具有免疫调节作用的T细胞亚群，具有免疫低反应及免疫抑制作用，在宫颈局部免疫微环境中维持着机体免疫耐受和免疫稳态的作用。Foxp3作为天然Treg的可靠标记物[11]，是Treg细胞的重要转录因子，对维持其免疫抑制起决定性作用。Foxp3在不同癌症中扮演着不同角色，如在乳腺癌、前列腺癌、胃癌中扮演着抑癌基因角色，而在胰腺癌及非小细胞肺癌中起着促癌作用[12]；EZH2是一种较为常见的组蛋白甲基转移酶，是癌症的重要表观遗传调控因子，可以通过调控组蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)，从而抑制Foxp3转录表达[13]，最终影响Treg细胞分化和功能维持。本课题组前期研究结果显示，Foxp3在宫颈癌SiHa细胞中扮演原癌基因的角色。但是否与EZH2有关，具体通过何种途径抑制SiHa细胞活性，需要深入基因表观遗传学及分子信号通路方面。本研究以宫颈癌SiHa细胞为研究对象，探讨清毒栓含药血清通过对SiHa细胞中EZH2及Foxp3表达的影响进而调控β-catenin信号通路，最终抑制宫颈SiHa细胞活性的机制，进一步阐明清毒栓作用的分子机制，为临床治疗宫颈HPV感染提供理论依据。

近年来，肿瘤的局部免疫环境成为肿瘤研究领域的热点，研究发现，在肿瘤的早期，机体的全身免疫功能并未出现明显的改变,但是肿瘤局部即已存在免疫抑制，而宫颈HR-HPV感染以及宫颈癌的发生与宫颈局部免疫微环境有着密切的关系。局部免疫微环境中Treg细胞是具有免疫调节作用的T细胞亚群，在肿瘤局部免疫反应中起决定性作用。Foxp3作为Treg重要的转录因子，是Treg细胞的重要标记物，对Treg细胞的分化和免疫抑制功能起决定性作用[14-15]。研究发现Foxp3在宫颈癌组织中表达升高，并与肿瘤的分期及生物学行为密切相关，由此可作为宫颈癌的筛查、术前疾病评估和术后随访的辅助指标, 也为临床靶向干预提供了理论依据[16]。肿瘤细胞表达的Foxp3促进肿瘤免疫逃逸，Foxp3可能通过非Treg细胞依赖的其他机制来影响肿瘤免疫微环境，进而促成肿瘤的免疫逃逸[15,17],临床研究发现，去除癌症患者CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞可提高宿主局部免疫功能并对抗肿瘤起一定积极作用[18]。启动子甲基化以及相关的组蛋白修饰的改变能够影响染色质构象和组织特异性基因表达的表观遗传学修饰[19]，Foxp3启动子区组蛋白甲基化修饰等表观遗传调控对于控制Treg细胞基因特别是Foxp3基因的表达起到很关键的作用，DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰形式，DNA高甲基化与基因沉默相关联，而去甲基化则与基因表达活性增加有关[20]。所以Foxp3启动子区组蛋白甲基化水平升高可能抑制其转录水平，降低Foxp3的表达。

Foxp3基因的表达调控中组蛋白H3K27的甲基化修饰起到重要作用。目前已知组蛋白H3K27的甲基化修饰受Polycomb基因家族蛋白复合体调控。Polycomb基因家族主要包括以mi1-Ring1b为核心组分的PRC1复合体以及以EZH2为核心组分的PRC2复合体。EZH2是含有保守SET功能区域的组蛋白甲基化酶，在PRC2蛋白复合体中起甲基酶活性催化作用。许多研究证实PRC1以及PRC2介导的H3K27甲基化修饰在癌症发生中起至关重要的作用。可利用EZH2组蛋白甲基转移酶活性将H3H27三甲基化，从而抑制靶基因转录,并参与调控细胞周期、细胞衰老、细胞分化等生理或病理过程[21]。Xie等[22]认为EZH2抑制剂逆转了H3K27me3的上调。可见EZH2是一种甲基转移酶，可以促进组蛋白甲基化。与不同的蛋白结合以及不同的细胞背景下，EZH2可以扮演抑制基因的角色，也可以活化基因表达[23]。虽然EZH2在多种肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤细胞增值、扩散和转移的恶性表现，但有学者认为EZH2在肿瘤发生发展中的作用机制复杂、具有双面性，而且在不同肿瘤细胞类型中作用不同[24]。Cardenas等[25]研究发现卵巢癌细胞中的EZH2通过维持E盒结合锌指蛋白(ZEB)2基因启动子区组蛋白H3K27三甲基化而抑制其表达，进而抑制卵巢癌细胞发生上皮间质转化、阻滞肿瘤迁移发生。

β-catenin是β-catenin信号通路的重要组成部分，可促进肿瘤细胞的浸润以及远处转移，从而加速肿瘤细胞的恶化[26]。研究发现，在乳腺癌、食管癌、结直肠癌等多脏器组织癌变中，均存在β-catenin异常表达。C-Myc属原癌基因，在Wnt/β-catenin细胞信号通路中发挥着重要作用，影响着细胞的增殖、分化、凋亡以及细胞周期的进程[27]。研究发现c-Myc的高表达可能促进宫颈癌的侵袭及转移[28]。Cyclin D1是细胞周期中与恶性肿瘤关系最为密切的癌基因之一，其高表达不仅能加速细胞增生分化，与肿瘤发生、进展有密切关系，还能经由调节基因转录程序致使染色体不稳定及肿瘤发生[29]。半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，当非活性的pro-Caspase-3被剪切后，产生活性的cleaved-Caspase-3，从而发挥催化酶的作用，在细胞凋亡过程中占据重要地位[30]。

本实验采用ChIP检测技术对Foxp3启动子区的组蛋白修饰进行分析定位，从而研究组蛋白的各种共价修饰与基因转录调控的关系，qRT-PCR技术实现了在Foxp3启动子上找到转录因子结合的直接证据。用Western Blot检测含药血清培养的SiHa细胞和空白血清培养的SiHa细胞中的EZH2含量，在两组基础上分别设置含药血清加抑制剂组和空白血清加抑制剂组，用CCK-8法检测四组细胞的活性。表明含药血清能增加EZH2的表达，含药血清组与其对照组相比，含药血清加抑制剂组与空白血清加抑制剂组相比，Foxp3表达显著降低，SiHa细胞活性下降，表明含药血清抑制Foxp3的表达，抑制SiHa细胞的活性；空白血清加抑制剂组与空白血清组相比，含药血清加抑制剂组与含药血清组相比，Foxp3表达显著增加，SiHa细胞活性升高，表明EZH2抑制剂GSK126能够逆转含药血清诱导的Foxp3表达降低及SiHa细胞活性下降。含药血清组与空白血清组相比，下游信号因子含量显著降低，并促进Caspase-3剪切，表明含药血清抑制β-catenin通路；空白血清加抑制剂组与空白血清组相比，含药血清抑制剂组与含药血清组相比，下游信号因子表达显著增加，并抑制Caspase-3剪切，表明EZH2能逆转含药血清诱导的β-catenin通路抑制。含药血清抑制剂组与空白血清加抑制剂组相比，Cyclin D1蛋白含量变化无明显统计学意义，表明含药血清可能是通过EZH2调节Cyclin D1蛋白的表达。

综上所述，清毒栓提取物通过促进宫颈癌细胞中EZH2表达，增加Foxp3启动子组蛋白甲基化水平从而抑制Foxp3表达，影响下游因子表达，最终抑制SiHa细胞活性。本研究进一步阐明清毒栓提取物通过调节EZH2抑制SiHa细胞活性的机制，为清毒栓治疗宫颈HPV感染提供理论依据，也为更多的宫颈癌药物研发提供一定的思路。但本实验不能完全解释清毒栓影响Foxp3表观遗传调控分子的精准机制，进一步结合慢病毒介导的敲降和过表达技术，研究Foxp3相关的H3K27甲基化修饰在人类子宫颈癌细胞中的作用和机制将会对宫颈癌的治疗提供有效的治疗方法。