林峻， 陈珏， 黄佳敏

(福州大学生物科学与工程学院， 福州大学应用基因组学研究所， 福建 福州 350108)

0 引言

基因定向进化是一种广泛应用的生物工程策略， 定向进化也称体外进化或实验室进化， 在无需完全了解蛋白质结构的情况下， 即可直接改进蛋白质功能. 定向进化的成功主要取决于两个方面： 高效构建突变文库和高通量筛选突变体[1-2]. 研究表明, 单个氨基酸突变就可以增强蛋白的催化活性或稳定性[3]， 但目前尚不清楚随机突变整个编码序列还是仅突变其活性位点更有效[4]. 研究人员已经开发出多种策略来产生分子多样性， 最广泛的方法就是随机突变. 随机突变与高通量筛选相结合， 是改善蛋白质功能或产生人工酶的一种通用策略[5-6].

传统的定向进化要求在一定的范围内突变目标核苷酸. 目前， 还没有一种高效的方法可以连续地改变目标区域的所有核苷酸[7-8]. 2018年， Halperin等开发了一种名为EvolvR的新型突变工具[9]. EvolvR将CRISPR/Cas9的特异性识别元件与易错DNA聚合酶的突变能力结合起来， 通过自主设计的含20个碱基的向导RNA(sgRNA)来实现精准定位. EvolvR有两个重要元件， 一是变体Cas9(nickaseCas9； nCas9)[10]， 其RuvC核酸酶结构域具有缺陷， 仅能诱发DNA单链断裂； 二是直接与nCas9融合的易错聚合酶(PolI3M)[11]. 聚合酶的保真度决定了突变率的高低. 研究表明， PolI3M是PolI中最容易发生聚合出错的变体. PolI3M包含3个点突变(D424A、 I709N和A759R)， 这些突变会增加其聚合酶活性的错误率并消除其校对活性. 该研究证明了这两个元件的融合， 可使PolI3M的突变……