孙力，胥剑雯，李庆会,翟永升，杨龙，张静，吴明德，李国庆

1.湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室/华中农业大学植物科学技术学院，武汉430070； 2.湖北省赤壁市植物保护站，赤壁 437300

油菜是我国重要的油料作物之一，每年种植面积约为700万hm2，油菜籽产量约为1 300万t[1]。在油菜生长过程中常常遭到多种病害侵袭，如菌核病(Sclerotiniastem rot)、黑胫病(blackleg)、霜霉病(downy mildew)和根肿病(clubroot)等，造成油菜籽减产，品质下降。菌核病由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起，在我国各油菜产区普遍发生，常年造成油菜籽产量损失达到10%～30%[2]。目前，没有发现高抗菌核病的油菜品种，因此，防治菌核病主要依靠栽培防治(水旱轮作)和化学防治。近年来，菌核病生物防治取得了长足进展。例如，源于我国本土的生防菌盾壳霉(Coniothriumminitans)已被正式登记为防治作物菌核病的生物农药(登记证号：PD20190019)。此外，一些枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株对油菜菌核病也有明显的防治效果[3-5]。

油菜黑胫病(blackleg)也称为茎点霉茎溃疡病(Phomastem canker)，由真菌复合种Leptosphaeriamaculans和Leptosphaeriabiglobosa引起[6]。这种病害曾先后在澳大利亚、加拿大、德国、法国和英国等地暴发流行，对油菜产业造成过毁灭性打击[7]。我国2000年正式报道油菜黑胫病[8]，病原是L.maculans中的B型，该类型后来被确定为L.biglobosa。普查结果显示：油菜黑胫病在我国各油菜产区普遍发生，在部分地区，油菜黑胫病病株率达到90%以上，病原均为L.biglobosa[9-11]。与健康植株油菜籽产量相比，发病植株油菜籽产量下降10%～50%[12-13]。但是，迄今没有专门针对L.biglobosa开展防控技术研究，主要原因是：在欧美、英国、加拿大和澳大利亚等油菜产区，同时存在L.maculans和L.biglobosa，但以L.maculans危害较重，因而防治重点放在L.maculans上。然而，在我国油菜产区尚未发现L.maculans，而L.biglobosa危害造成的油菜籽产量损失不可忽视[12-13]。因此，有必要借鉴国外防控L.maculans的经验，例如Danielsson等[14]利用淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)有效抑制L.maculans、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)以及芸薹链格孢(Alternariabrassicae)等病原真菌侵染油菜组织；Abuamsha等[15]用普利茅斯沙雷菌(Serratiaplymuthica)和绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)引发处理油菜种子，降低L.maculans侵染等来开展国内油菜L.biglobosa的防控技术研究。

笔者所在课题组从健康油菜植株中分离到贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)菌株CanL-30，发现该菌株对菌核病菌(S.sclerotiorum)、黑胫病菌(L.biglobosa)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)和立枯病菌(Rhizoctoniasolani)等病原真菌均有拮抗作用，且在盆栽试验中对油菜菌核病显示出明显的防治效果[16]。由于菌株CanL-30存在着开发利用的潜力。我们针对菌株CanL-30的规模化发酵、可湿性粉剂制备、可湿性粉剂防治油菜菌核病和黑胫病效果评估等方面开展了专门研究，以期为该菌株的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

供试菌株包括贝莱斯芽孢杆菌CanL-30、油菜菌核病菌菌株Ss-1和油菜黑胫病菌菌株W10。菌株CanL-30分离自健康油菜植株[16]，菌株Ss-1分离自油菜菌核病菌菌核[16]，菌株W10分离自油菜黑胫病发病植株[12]。

供试培养基包括以下4种：(1)牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)：牛肉浸膏3 g、胰蛋白胨5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 000 mL，琼脂粉15 g，pH 7，用于培养菌株CanL-30(作为发酵菌种)；(2)小型罐(10 L)发酵培养基：牛肉浸膏3 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、葡萄糖20 g/L，pH 7；(3)大型罐(1 t和10 t)发酵培养基：鱼蛋白胨0.8%、酵母粉0.8%、米粉1.5%、小麦粉3%、硫酸镁0.35%、轻质碳酸钙0.3%、工业盐0.25%，pH 7，用于发酵菌株CanL-30；(4)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA):去皮马铃薯薯块200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL，自然pH值，用于培养油菜菌核病菌和油菜黑胫病菌以及测定CanL-30可湿性粉剂的抗真菌活性。

1.2 菌株CanL-30菌体及芽孢形成动态观察

将CanL-30菌体悬液接种在10 L发酵罐中，在30 ℃条件下培养。在2～12 h时间段，每隔2 h取1次样，在12～96 h时间段，每隔12 h取1次样。用分光光度计测定每份样品在600 nm处的吸光值(OD600)。同时，将菌液涂布在载玻片上，滴加饱和孔雀蓝(7.6%)染色10 min，用无菌水轻轻冲洗至不再褪色为止，用番红(0.5%)复染1 min，无菌水冲洗后晾干，在光学显微镜下观察CanL-30菌体和芽孢形态，随机挑选10个视野，统计芽孢(游离芽孢及芽孢囊中的芽孢)所占比例(芽孢形成率)。

在大型发酵罐中接种CanL-30菌体悬浮液，1 t罐发酵的发酵条件是：罐压0.05 MPa，温度(30±1) ℃，搅拌装置常开，无菌空气流量是：18 m3/h(0～6 h)，30 m3/h(6～10 h)，40 m3/h(10～30 h)，18 m3/h(30 h～放罐)。10 t罐发酵的罐压和发酵温度与1 t罐发酵相同，搅拌装置也保持常开，无菌空气流量是：180 m3/h(0～6 h)，250 m3/h(6 ～10 h)，360～400 m3/h(10 ～30 h)，180 m3/h(30 h～放罐)。发酵6、12、16、20、24、28和35 h后取发酵液样品，涂片，染色，观察芽孢产生动态，在NA培养基上涂布发酵液，测定发酵液中的细菌数量。发酵36 h后(芽孢形成率超过93%)，往发酵罐中添加适量冰醋酸，终止发酵。

1.3 可湿性粉剂制备

将菌株CanL-30发酵菌液离心，并在沉淀的菌浆中添加适量的保护剂，喷雾干燥，得到菌粉。喷雾干燥的条件是：进风温度180 ℃，出风温度65 ℃，空气进泵速度约3 000 mL/h。在菌粉中添加硅藻土(6%,m/m)、木质素磺酸钠(4.8%,m/m)、糊精(0.1%,m/m)和羟甲基纤维素钠(2%,m/m)，用雾化粉碎机将混合物加工成颗粒大小为25 μm左右的粉剂。按《GB/T 19136—2003》中的方法测定粉剂热贮稳定性；按《GB/T 14825—2006》中的方法测定粉剂的悬浮率；按《GB/T 5451—2001》中的方法测定粉剂的润湿性。同时，将粉剂在室温下储存1 a，测定其中的活菌数量，根据菌落形态判断是否属于芽孢杆菌。

1.4 可湿性粉剂抗真菌活性测定

1)CanL-30可湿性粉剂对核盘菌菌丝生长和菌核产生的抑制作用。采用带毒平板法进行测定。用无菌蒸馏水将CanL-30可湿性粉剂稀释10倍，离心，将上清液吸出，分成2份，1份上清液样品用细菌过滤器过滤除菌(滤膜孔径0.22 μm)，另1份上清液样品在湿热灭菌锅中灭菌(121 ℃，25 min)。将2种处理上清液分别添加至PDA培养基中，按粉剂质量折算上清液添加量，将粉剂分别稀释至100、300、500、1 000、5 000、10 000、50 000、100 000和1 000 000倍，制成平板(直径6 cm)，以不加粉剂上清液的PDA平板为对照。将核盘菌菌丝块(直径5 mm)接种至各平板中央。在20 ℃下培养36 h，测量各平板核盘菌菌落直径，将各上清液处理菌落直径与对照处理菌落直径进行比较，计算抑菌率。再培养15 d，统计各平板产生的菌核数量。

2) CanL-30可湿性粉剂对油菜黑胫病菌W10分生孢子萌发的抑制作用。采用牛津杯扩散法测定。在PDA平板上接种菌株W10，在20 ℃培养15 d，用无菌蒸馏水洗下菌落表面的分生孢子，得到孢子悬浮液(1×108个孢子/mL)。然后，将孢子悬浮液按1∶7体积比添加至PDA培养基中，制成带菌平板，将灭菌牛津杯(孔径6 mm)置于平板表面。同时，取CanL-30粉剂10 g，溶于100 mL无菌水中，充分混合，静置30 min，离心(5 000 r/min)10 min，取200 μL上清液，添加至牛津杯中。此外，试验设阴性对照和阳性对照。在阴性对照中，取200 μL无菌水，添加至牛津杯中；在阳性对照中，将CanL-30发酵液(48 h)离心，取200 μL上清液，添加至牛津杯中。上述各处理重复6次，并将各处理平板置于20 ℃下培养3 d，观察牛津杯周围是否有透明圈产生(指示抗菌作用)。

1.5 可湿性粉剂防病效果评估

1)油菜菌核病和黑胫病的室内防效试验。在防治油菜菌核病的室内试验中，将油菜花瓣(病菌易感染器官)置于离体油菜叶片上，将核盘菌子囊孢子悬浮液(4 × 105个孢子/mL)滴加在花瓣上，每个花瓣接种100 μL菌悬液，再将花瓣放在油菜叶片上，每个叶片上放置2个花瓣。试验分以下4种处理，每种处理6片叶：(1)对照处理，记为Ss，油菜花瓣上仅含有核盘菌子囊孢子；(2)CanL-30发酵液原液(CF)+ 核盘菌，记为CF + Ss。在接种核盘菌子囊孢子的花瓣上滴加CanL-30发酵液原液，每个花瓣100 μL；(3)CanL-30发酵液1 000倍稀释液+核盘菌，记为 CF1000 + Ss。在接种核盘菌子囊孢子的花瓣上滴加CanL-30发酵液1 000倍稀释液，每个花瓣100 μL；(4)CanL-30可湿性粉剂100倍稀释液 + 核盘菌，记为Powder 100 + Ss，在接种核盘菌子囊孢子的花瓣上滴加CanL-30可湿性粉剂100倍稀释液，每个花瓣100 μL。将所有处理的油菜叶片置于保湿箱中(20 ℃)，培养7 d后测定花瓣周围病斑直径。

2)油菜黑胫病室内防效试验。将CanL-30可湿性粉剂稀释100倍的稀释液喷雾至油菜叶片上，以CanL-30发酵液原液(发酵72 h)和水喷雾分别作为阳性对照和阴性对照。待叶片干燥之后，将油菜黑胫病菌W10菌丝块(直径为5 mm)接种至油菜叶片上。最后，将3种处理的油菜植株置于保湿箱中(20 ℃)培养，7 d后测定病斑直径。

3)田间防效试验。分别在湖北省天门市和赤壁市两地进行。在每个试验点选择长势旺盛的油菜田，划分9个小区，小区面积约为50 m2，设3种处理，每处理设3次重复：(1)自来水对照；(2)杀菌剂咪鲜胺，剂型为咪鲜胺水乳剂，有效成分质量浓度为450 g/L，河南广农农药厂产品，田间喷雾药液中有效成分质量浓度为562.5 μg/mL；(3)CanL-30可湿性粉剂，用量为100 g/667 m2。用手动喷雾器将水、咪鲜胺药液和CanL-30可湿性粉剂稀释液分别喷雾至各小区油菜植株上，分2次喷雾，第1次喷雾时间为2019年1月22日，油菜处于抽薹期。第2次喷雾时间是2019年3月1日，油菜处于中花期。在油菜成熟期，采用五点取样的方法调查各处理小区菌核病和黑胫病的发病情况。天门市试验点的调查时间是2019年4月30日，赤壁试验点调查时间是2019年5月6日。油菜菌核病的分级标准为0级(健康)至4级(主茎秆枯死或2/3分枝发病)[2]，油菜黑胫病的分级标准为1级(健康)至6级(茎秆自溃疡处折断)[17]，根据调查结果计算发病株率和病情指数。同时，在每个小区随机取3个1 m2面积的油菜植株，带回实验室，测定油菜籽产量，折算成亩产量(kg/667 m2)。

1.6 数据统计分析

用SAS软件(SAS Institute,Cary,NC,USA,v. 8.0,1999)中的方差分析程序(analysis of variance,ANOVA)分析各试验中不同处理各指标数据之间的显著性。对于百分率数据(如发病株率)，在ANOVA分析之前，通过反正弦转换，将百分率变成角度值，分析完成之后，再将平均值转换成百分率。采用最小显著差异法检验(the least significant difference test,LSD)分析各试验不同处理之间的差异显著性(α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株CanL-30菌体生长和芽孢发育动态

在10 L发酵罐中，贝莱斯芽孢杆菌CanL-30在牛肉汁蛋白胨培养液中发酵2～12 h(30 ℃)，菌体数量呈对数上升，24 h后菌体数量趋于稳定，48 h后芽孢形成率为74%，72 h后芽孢形成率达到100%(图1)。在1 t发酵罐中发酵时，2～16 h为菌体对数生长期，24 h开始形成芽孢，32 h后菌体数量进入稳定期，36 h后芽孢形成率达到93%，终止发酵。最终发酵液中活菌浓度为1×1010cfu/mL，喷雾干燥得到7 kg菌粉，活菌含量为6×1011cfu/g。在10 t发酵罐中发酵时，40 h后芽孢形成率达到92%，终止发酵。发酵液中活菌浓度为3.3×109cfu/mL，喷雾干燥得到190 kg菌粉，活菌含量为2×1011cfu/g。

A：菌体增殖和芽孢形成动态；B：菌体和芽孢形态，菌体紫色或红色，芽孢无色。A:Curves of bacterial growth and endospore formation rates by strain CanL-30; B:Morphology of the peacock blue/safranine O-stained bacterial cells and endospores,purple and red color for bacterial cells and the colorless part inside each bacterial cell for the endospore.图1 菌株CanL-30在10 L发酵罐中菌体生长及芽孢发育动态Fig.1 Dynamics of growth and endospore development in strain CanL-30 of B. velezensis in a 10 L jar fermenter

2.2 菌株CanL-30可湿性粉剂制备及质量

将发酵得到的干菌粉与硅藻土(6%,m/m)、木质素磺酸钠(4.8%,m/m)、糊精(0.1%,m/m)以及羟甲基纤维素钠(2%,m/m)混合，用雾化粉碎机将混合物加工成颗粒大小为25 μm左右的粉剂，平均活菌含量为2.0×1011cfu/g，粉剂热贮(54 ℃)稳定性为83.3%，悬浮率为98.2%，润湿时间为105 s，达到了农药可湿性粉剂的相关国家标准。将可湿性粉剂在室温下(20±5 ℃)储存1 a，活菌含量维持在1 000亿cfu/g水平。

2.3 菌株CanL-30可湿性粉剂的抗菌活性

对油菜菌核病菌抑制抗性的测定结果显示：过滤灭菌上清液稀释100倍的抑菌率为100%，稀释1 000倍的抑菌率为46%。高温灭菌处理上清液稀释100倍的抑菌率为100%，稀释1 000倍的抑菌率为35%。进一步提高稀释度，2种灭菌处理的上清液均丧失了抑菌效果。稀释100～10 000倍的上清液完全抑制菌核形成，稀释50 000～1 000 000倍上清液的菌核产量为7～10粒/皿，显著(P<0.05)低于对照处理的菌核产量(13粒/皿)(图2)。以上结果表明：无论是过滤灭菌还是高温灭菌，CanL-30粉剂上清液对核盘菌菌核形成都有明显的抑制作用。

图2 菌株CanL-30可湿性粉剂对核盘菌抑菌率(A)和菌核形成(B)的抑制作用(显著性水平:ɑ=0.05)Fig.2 Antifungal activity of the CanL-30 water wettable powder on inhibiotion rate(A) and sclerotial formation(B) by S. sclerotiorum(significant at ɑ = 0.05)

在抑制油菜黑胫病菌的试验中，CanL-30粉剂提取物上清液和发酵物离心上清液均有抑菌圈产生(图3)，说明CanL-30可湿性粉剂中含有抑制油菜黑胫病菌分生孢子萌发的抗菌物质。

图3 菌株CanL-30可湿性粉剂对油菜黑胫病菌分生孢子萌发的抑制作用Fig.3 Inhibition of conidial germination of L. biglobosa by the antifungal substances in the water wettable powder of strain CanL-30 of B. velezensis

2.4 菌株CanL-30可湿性粉剂的防病效果

室内试验和田间试验结果均显示：CanL-30可湿性粉剂对油菜菌核病和黑胫病具有明显的防治效果。在室内防治油菜菌核病试验中，对照处理(仅含核盘菌Ss)的花瓣造成的叶片病斑直径为25.6 mm，CF 1000 + Ss处理(发酵液稀释1 000倍+核盘菌)的花瓣造成的病斑平均直径为15.3 mm，较对照处理下降40.2%；CF+Ss处理(发酵液原液+核盘菌)和Powder 100 + Ss(粉剂稀释100倍+核盘菌)处理花瓣在叶片上没有病斑产生(图4)，可见，CanL-30可湿性粉剂对花瓣介导的核盘菌子囊孢子侵染油菜叶片具有明显的抑制作用。

在室内防治油菜黑胫病试验中，用油菜黑胫病菌接种不同处理的油菜叶片，在20 ℃下培养7 d，对照处理的叶片造成的病斑平均直径达8.6 mm，而CanL-30发酵物原液处理和粉剂处理造成的病斑平均直径分别为1.8 mm和1.0 mm(图5)，较水处理病斑直径分别降低79.1%和88.4%。可见，CanL-30可湿性粉剂可有效抑制油菜黑胫病菌的侵染。

室内试验；水=核盘菌；发酵液1 000=发酵液1 000倍稀释液+核盘菌；发酵液原液=未稀释发酵液+核盘菌；粉剂100=粉剂稀释100倍+核盘菌；显著性水平：ɑ=0.05。Indoor trial. Water=S. sclerotiorum alone; CF 1000= Cultural filtrate diluted by 1 000 times+S. sclerotiorum; CF=Undiluted cultural filtrate+S. sclerotiorum; Powder 100=Powder diluted by 100 times+S. sclerotiorum. Significant at ɑ= 0.05.图4 菌株CanL-30可湿性粉剂防治油菜菌核病效果Fig.4 Efficacy of the water wettable powder of CanL-30 on suppression of flower-mediated infection by S. sclerotiorum on oilseed rape leaves

图5 菌株CanL-30可湿性粉剂防治油菜黑胫病效果(室内试验，显著性水平:ɑ= 0.05)Fig.5 Efficacy of the water wettable powder of CanL-30 in suppression of infection by L. biglobosa on leaves of oilseed rape (Indoor trial,significant at ɑ= 0.05)

在田间喷施CanL-30粉剂和咪鲜胺的小区，油菜菌核病和油菜黑胫病发病率及病情指数均显著(P< 0.05)低于处对照处理(图6，图7)。在天门市试验点，咪鲜胺对油菜菌核病和黑胫病的防效(与对照相比病情指数下降的百分率)分别为51%和40%，CanL-30可湿性粉剂对油菜菌核病和黑胫病的防效分别为58%和51%。在赤壁市试验点，咪鲜胺对油菜黑胫病和菌核病的防效分别为17%和30%，CanL-30可湿性粉剂对油菜菌核病和黑胫病的防效分别为52%和33%。测产结果显示：与对照相比，CanL-30可湿性粉剂在天门市试验点和赤壁市试验点油菜籽产量分别提高14%和12%。

A,B:油菜菌核病； C,D:油菜黑胫病； 显著性水平：ɑ=0.05。A and B:Sclerotinia stem rot; C and D:Blackleg; Significant at ɑ=0.05.图6 菌株CanL-30可湿性粉剂防治油菜黑胫病和菌核病田间小区试验效果(湖北省天门市试验点)Fig.6 Efficacy of the water wettable powder of CanL-30 on suppression of Sclerotinia stem rot and blackleg of oilseed rape in the field trial in Tianmen City of Hubei Province

A,B:油菜菌核病； C,D:油菜黑胫病；显著性水平，ɑ=0.05。A and B:Sclerotinia stem rot; C and D:Blackleg; Significant at ɑ=0.05.图7 菌株CanL-30可湿性粉剂防治油菜黑胫病和菌核病田间小区试验效果(湖北省赤壁市试验点)Fig.7 Efficacy of the water wettable powder of CanL-30 in suppression of Sclerotinia stem rot and blackleg of oilseed rape in the field trial in Chibi City of Hubei Province

A和B分别代表湖北省天门市试验点和赤壁市试验点，显著性水平：ɑ=0.05。A and B for Tianmen and Chibi trials,respectively,significant level at ɑ=0.05.图8 使用菌株CanL-30可湿性粉剂对油菜籽产量的增产效应Fig.8 The seed yield-incresing effect on oilseed rape upon application of the waterwettable powder

3 讨 论

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是2005年由Ruiz-Garcia等[18]、Borriss等[19]学者建立的一个芽孢杆菌属新种，与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)亲缘关系较近。研究结果表明：贝莱斯芽孢杆菌是重要的植物病害生防菌资源[20]。这种细菌对多种植物病原真菌引起的病害具有防治效果，包括：番茄早疫病(Alternariasolani引起)、作物炭疽病(Colletotrichumspp.引起)、作物灰霉病(Botrytiscinerea引起)、小麦全蚀病(Gaeumannomycesgraminisvar.triciti引起)和小麦根腐病(Bipolarissorokiniana引起)、番茄黄萎病(Verticilliumdahliae引起)、稻瘟病(Magnaportheoryzae引起)[16,21-24]。本研究结果表明：贝莱斯芽孢杆菌菌株CanL-30对油菜菌核病和黑胫病具有明显的防治效果。这一结果拓宽了贝莱斯芽孢杆菌的防病谱。此外，本研究建立了中等规模(1 t和10 t)的发酵工艺，制备了可湿性粉剂，为菌株CanL-30作为生物农药登记奠定了基础。

从前人的研究结果可以看出：贝莱斯芽孢杆菌的防病机制在于产生脂肽类抗菌物质，促进植物生长以及诱导抗病性[25-28]。就产生抗菌物质而言，菌株CanL-30能够产生广谱性抗真菌物质，对油菜菌核病菌、黑胫病菌、灰霉病菌和立枯丝核菌等病原真菌有抑制作用[16]。在本研究中，我们发现：菌株CanL-30可湿性粉剂中含有抑制油菜菌核病菌菌丝生长及菌核产生的抗菌物质，该物质还可以抑制油菜黑胫病菌分生孢子萌发。可湿性粉剂中的抗菌物质是从CanL-30发酵物中浓缩出来的，对粉剂防病效果有一定作用。目前，我们还不清楚CanL-30粉剂中的抗真菌物质种类，今后将进一步开展相关研究，一旦明确了抗真菌物质种类及其防病作用，可望将其作为CanL-30可湿性粉剂的产品质量标准。

就促进植物生长而言，菌株CanL-30产生的挥发性有机物能够显著促进拟南芥生长[16]。本研究发现：在油菜蕾薹期和花期使用CanL-30可湿性粉剂喷雾可以提高油菜籽产量。对油菜籽增产效应可能源于两个方面的机制：一是抑制菌核病和黑胫病发病率及病害严重度；二是菌株CanL-30产生的促进油菜生长的物质。我们测定了菌株CanL-30产生的挥发性有机物成分(未发表资料)，但还没有对这些成分进行逐一筛选，这也是下一步需要完成的研究工作。

菌株CanL-30通过产生挥发性有机物促进拟南芥生长[16]，说明它对拟南芥的生长发育有调控作用。可以推定：菌株CanL-30在调控拟南芥生长的过程中，可能影响拟南芥的抗病性，但目前还不明确菌株CanL-30是否具有诱导油菜抗病性的能力。这需要作进一步验证。