张云亮，朵慧，张阳阳，栗金富，徐丽萍*，窦博鑫*

1.哈尔滨商业大学食品工程学院（哈尔滨 150076）；2.兰州兰生血液制品有限公司（兰州 730030）

由于人口增加与采用富含蛋白质的饮食，众多国家蛋白质消耗量增加，且随着人类生活水平的不断提高，这种影响可能会加剧，因此筛选对环境友好的新型蛋白质来源非常重要。微藻是一种广泛存在于陆地与海洋中的植物，其胞体内具有众多不饱和脂肪酸、功能性蛋白质、多糖等对人体有益的物质[1-4]，且具有环境适应力强、培养周期短、培养占地面积小等众多优点[5-6]，但由于微藻加工成本及耗能高等一系列瓶颈问题的存在，微藻蛋白质至今难以实现工业大规模生产。

微藻细胞壁对生物活性物质的提取具有极大的影响[7-8]，大部分微藻细胞的细胞壁结构复杂，诸如小球藻和栅藻有两层细胞壁，红球藻有三层细胞壁，莱茵衣藻有五层细胞壁[7,9]。因此，为提高微藻细胞蛋白质的提取率，必须利用机械或非机械破碎的方法对微藻的细胞壁进行破碎处理，且选择合适的破碎技术与破碎力度对于提取微藻蛋白质具有决定性的作用。综述主要探讨了传统细胞破碎方法中的珠磨法、超声处理法、生物酶解法与新兴细胞破碎方法动态高压微射流处理法、超临界流体空化法、多针-板电晕放电法及纯化双水相萃取法7种微藻细胞破碎技术及蛋白质提取技术的研究进展与研究方向，为日后微藻细胞破碎提取内容物提供技术参考。

1 传统细胞破碎处理方法

1.1 珠磨法

传统细胞破碎方法中的珠磨法被认为是最有利于放大为工业生产的细胞破碎方法之一。珠磨法是通过器械腔体内的磨珠高速转动，机轴的不断转动带动腔体内微藻细胞与珠磨之间相互碰撞、剪切，从而造成微藻细胞的破碎，使内容物溶出[10]。珠磨法可连续应用于细胞破碎且细胞破碎率高，通过球磨机自身所带的冷却水冷却系统，能很好地控制细胞破碎过程中温度的升高，利用于工业化生产具有极高的可能性。

目前珠磨法已被广泛应用于微藻细胞蛋白质与油脂的提取过程中，Safi等[11]通过研究不同细胞破碎方法表明高压匀浆法与珠磨法在细胞破碎释放蛋白质中最为有效，细胞崩解率＞95%，总蛋白释放量达50%，且能量输入较脉冲电场处理法低数十倍，该研究表明珠磨法是一种耗能低、蛋白质释放率高的细胞破碎技术。Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相结合的方法，将细胞经球磨处理后，用不同的水解酶水解，单纯珠磨法脂类、碳水化合物和蛋白质的回收率分别为75%，31%和40%，而采用酶处理可显著提高此结果，各组分的回收率均达到最大值，固相可得88%油脂，液相可分离出74%的碳水化合物和68%的蛋白质，故在研究应用过程中生物酶解技术与物理珠磨法的结合更有利于微藻细胞蛋白质溶出。刘习军[13]通过利用超声波辅助涡轮式珠磨机破碎球藻细胞，表明辅用超声波法后，珠磨法破碎细胞时间由35 min降至20 min，且细胞破壁率达到95%以上，可促进珠磨法在工业中的应用。由此可见，细胞破碎技术的结合使用比单独使用一种破碎方法蛋白质溶出率更高、溶出时间更短，除此之外的其他结合方法与实现大规模的工业应用有待日后科研人员的研究探讨。

1.2 超声处理法

超声波处理法是通过超声波高强度声能输入下达到细胞破碎的一种方法[14-15]。此方法与超声波空化现象相关[16]，超声处理法通过高强度声能的输入，使含有微藻细胞的溶液局部出现负压区，进而在负压区形成大量的空泡与微小的气泡，负压区的气泡稳定性极差，产生后不久便会破碎，当大量的气泡破损的瞬间将产生较大的爆破压力，从而产生剧烈的冲击波，在冲击波的作用下细胞壁结构受到冲击而破碎内容物溶出[13]。

Schwede等[17]、Lee等[18]、Lee等[19]研究表明利用超声波处理法进行细胞破碎，破壁率与超声波振幅、频率、超声处理时间、细胞种类等因素均有密切关系，处理过程各因素的试验参数需要按照不同细胞种类进行试验确定，不同因素间的互交作用有待进一步研究。Al-Zuhair等[20]研究表明超声处理参数为1 000 W、3 min时，栅藻和莱茵衣藻的蛋白质提取率＞70%。Zhang等21]研究建立了乙醇浸泡、酶消化、超声和均质技术相结合的细胞破碎方法。利用该方法从微藻中提取了72.4%的蛋白质，此结果微藻细胞蛋白质溶出率远远大于Safi等[11]利用高压匀浆法与珠磨法结合，总蛋白释放量达50%，此研究也进一步证实各破碎方法的结合是一种潜在的微藻蛋白提取方法，有助于微藻细胞蛋白资源在功能性食品和医药中的充分开发利用，自此更多细胞破碎技术的互交作用的机理与应用参数有待进一步的探讨。

1.3 生物酶解法

生物酶解法因其温和的作用条件、高度的专一性早已被广泛应用于细胞破碎处理中，但高度专一性的酶筛选不易，且将生物酶解法应用于大规模的工业化生产中成本较高，因此该法在细胞破碎工业化生产中的利用具有一定的困难。

张睿林[22]通过生物酶解、乙醇浸泡、超声处理与均质处理结合提取球藻蛋白研究表明，利用纤维素酶pH 5.0条件下水解3 h，超声处理功率1 000 W处理36 min，萃取10 min，蛋白提取率高达72.3%。相比Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相结合方法68%的蛋白质溶出率更高。两者研究的对比更进一步证实了多种细胞破碎方法优点的结合更有利于细胞内蛋白质的提取，但各个技术相互作用的影响、是否可进行互交及参数的确定需进一步研究。

生物酶解法应用于细胞破碎虽条件温和，有利于保留蛋白质及功能性多肽的活性，但处理成本过高，现阶段可考虑通过使用固定化酶技术将酶进行固定化，实现生物酶的连续化使用，降低生产成本。在使用生物酶法处理过程当中还需严格控制酶的处理温度及pH等酶活性的关键影响因素，以防止在酶解过程中由于不当操作而造成的酶变性失活。在今后研究过程中，也可致力于高度专一性、抗高压、抗高温酶的筛选，以适应不同细胞破碎环境，进而大幅度提高细胞破碎率及蛋白质溶出率。

2 新兴细胞破碎处理方法

2.1 动态高压微射流处理法

动态高压微射流处理法是一种耗能的新兴高压细胞破碎技术，该方法与传统的高压匀浆法不同，操作过程中碰撞所产生的能量更大、压力更高。微射流法是通过将两股含有细胞颗粒的悬浊液高速撞击，利用细胞激烈撞击时所产生的巨大瞬间能量，促使细胞破碎[23-24]，因此利用该法进行细胞破碎的细胞破损率与细胞浓度、碰撞次数、处理压力等因素具有直接联系。由于该法是利用细胞剧烈碰撞产生能量而促使细胞破碎，故细胞破碎瞬间会产生大量的热能，使操作室温度急剧升高，因此如何高效控制操作室温度、避免对细胞溶出物活性的影响还需进一步探究。

Cha等[25]采用体外消化和人肠道Caco-2细胞模型，研究表明微射流处理可提高微藻细胞叶黄素胶束化效率，在68.96 MPa以上压力下处理后，扫描电镜观察细胞平均粒径由3.56 μm降至0.35 μm。与未经处理的细胞相比，137.93 MPa条件下的微藻细胞水溶液微射流处理后生成叶黄素胶束的效率提高了3倍。Xia等[26]采用微射流和密度分离相结合的方法，从碎米中提取蛋白质，辅以后续酶处理（淀粉酶和糖化酶）后，蛋白质回收率高达81.87%，纯度达87.89%，结果表明，酶辅助微射流技术是一种无破坏、选择性提取蛋白的有效方法，但利用于微藻细胞蛋白质的提取工艺需进一步研究。除生物酶解技术与微射流处理法结合作用于微藻细胞蛋白质提取外，其他技术与高压微射流处理相结合的作用与效果有待进一步探讨，进一步发掘出使蛋白质提取率更高的方法，而且如何使该方法能耗与产出相对合理分配，也需结合作用机理进一步研究。

2.2 超临界流体空化法

超临界流体空化法是通过使用CO2、N2等利用高压将其渗透进入细胞内，再将高压环境瞬时降为低压环境，通过外压环境的瞬间变化使细胞膨胀破裂的方法[27]。相比于传统的珠磨法、高压匀浆法与高压微射流处理法，超临界流体空化法避免了剧烈能量的变化而造成的温度过高现象，亦避免了生物酶解处理过程中污染严重、杂质增加、控制参数繁多等不利影响，是一种微藻细胞破碎处理的绿色、高效、稳定的处理方法。

刘明磊[28]通过流体空化法对绿球藻细胞进行破壁处理，当破壁时间为30 min时，破壁率可达90%，改变处理压力从0.1 MPa升至0.25 MPa时，绿球藻细胞破壁率提高了30%。胡爱军等[29]采用超临界CO2流体辅以超声处理，在超临界CO2流体处理海藻细胞破碎的同时辅以超声处理法，两种方法的结合不会破坏海藻细胞内的生物活性物质，且能够有效地增加海藻细胞内二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的提取率。将超临界CO2流体结合超声处理的方法应用于微藻细胞蛋白质提取过程参数与对蛋白质提取率的影响还待研究。Dierkes等[30]通过超临界CO2流体处理淋球菌，使菌体细胞破碎内容物脂质与虾青素溶出，两种物质提取率分别达80%与90%左右，相对于传统细胞破碎方法，超临界流体空化法清洁、高效的破碎效果使其在细胞破碎提取内容物研究当中具有很高的潜力。

2.3 多针-板电晕放电技术

多针-板电晕放电法是一种新型的细胞破壁提取内容物的方法，该方法是通过将多余正负电荷中和而产生能量的过程，中和过程产生的能量将细胞壁与细胞膜电穿孔，使膜崩解，从而造成细胞内容物溶出得以提取利用[31]。赵丽[32]通过研究利用多针-板电晕放电技术在电压8 000 kV、处理时间1 min的条件下即可破碎藻体细胞，使藻体细胞内溶物溶出，相较于其他细胞破碎方法，该方法处理时间短且高效，但该技术在微藻细胞破碎的相关研究较少，且如何控制高压与放电方式等对于微藻细胞破碎的影响及参数的确定暂无相关详细报道。

多针-板电晕放电技术操作简单且细胞破碎效率高、耗时短、破碎过程所需成本低，具有工业化大规模生产利用的良好优势，但如何进行规范进行大规模使用、如何控制参数的变化、如何使用正确放电技术需相关研究进一步探讨。

3 双水相萃取纯化微藻蛋白

微藻细胞破碎后内容物蛋白质溶出还需进行下一步分离纯化以得到纯度高的蛋白质。传统的微藻蛋白分离纯化的方法有羟基磷灰石层析法[33]、凝胶层析法[34]、离子交换法[35]等，这些传统的方法在蛋白质分离纯化过程中步骤繁多、耗能大、分离周期长，且在工业化生产利用过程中价格昂贵，故大批量生产困难。

双水相萃取技术是使用多种物质以一定比例的质量分数溶解于水中，以形成互不相容的水溶液体系，有聚合物-有机盐-水、聚合物-聚合物-水、聚合物-无机盐-水、表面活性剂-表面活性剂-水、有机溶剂-无机盐-水等类型[36]，与传统分离纯化的层析法相比，双水相萃取法环保、纯化效率高，通过与超滤、等电点沉淀、结晶等粗提取方法结合，更有利于细胞流出蛋白质的纯化。王巍杰等[37]利用一定比例浓度的PEG与酒石酸钾钠双水相萃取，pH 6.0条件下在此双水相体系中藻蓝蛋白被萃取至上相，最高纯度为3.69，回收率高达到94.56%。付丽丽等[38]利用PEG与酒石酸钾钠形成的双水相体系进行纯化钝顶螺旋藻藻蓝蛋白，在pH 6.5条件下藻蓝蛋白回收率达到93.07%。田盼盼等[39]通过建立逐级盐析结合双水相萃取技术，在不同浓度的(NH4)2SO4数次盐析后得藻蓝蛋白，再用质量分数10%的聚乙二醇6000、18%的(NH4)2SO4进行双水相萃取。所得产物纯度可达到8.6，回收率为71.40%。由此对比可得逐级盐析与双水相萃取结合的方法能显著提高产物的纯度。盛晶梦等[40]采用粉末活性炭吸附与双水相萃取法相结合，对藻蓝蛋白进行纯化提取，利用PEG与硫酸盐组成的双相中进行萃取，在pH 7.0条件下藻蓝蛋白纯化后纯度达3.46，回收率达63%。双水相萃取法与其他预处理或预提纯等方法的结合与互作还需进一步考察。

相比于传统的萃取方法，双水相萃取法在纯化蛋白质等生物活性物质的过程中，提供了温和的大环境，在提取过程中避免了传统萃取方法所造成的蛋白质变性与活性破坏等不利影响，但双水相萃取技术起步较晚，且双相系统中所使用的聚合物多集中于市面上常见的聚合物质，双水相萃取技术能否大量应用于微藻蛋白质提取，还需进一步探究与其他技术相结合的互作影响，提取过程中的动力学、热力学变化影响及提取工艺的进一步优化。

4 结语与展望

微藻细胞由于蛋白质含量高、蛋白质量优质等众多优点而被广泛开采利用，但微藻细胞复杂的胞壁结构，必须进行适当的细胞破碎后才能使蛋白质溶出、提取、利用。现有的细胞破碎方法多数耗能高、温度变化大，对蛋白质提取具有众多不利影响。为充分破碎微藻细胞、提高微藻蛋白质纯度及回收率，可注重研究各细胞破碎方法之间的结合利用与互作影响。各预处理技术与深度纯化技术相结合，提高蛋白质的回收率。筛选抗高温、高压条件的酶类与细胞破碎技术结合利用，深度研究双水相萃取技术与其它萃取技术的结合使用，更需进一步深层次地研究其各细胞破碎、预处理、纯化技术的作用机理，以实现微藻蛋白质的大规模生产。