张旭

（天津医科大学口腔医院 · 天津医科大学口腔研究所，天津 300070）

龋病为全球发病率最高的疾病（35%，2010年）[1]。因此，早期预防和治疗牙釉质龋将节省大量治疗费用和医疗资源，尤其是针对治疗不配合的幼儿和残障人士、行动不便的老年人，甚至也包括较长时间在外执行任务的航天员、军队士兵等特殊人群，或在口腔医生职业暴露风险提高的公共卫生事件中，不便开展有创治疗时，亟需一种快速高效地恢复天然/类天然牙釉质硬组织的仿生再矿化方法。本文拟从仿生角度浅谈釉质发生过程与釉质仿生矿化之间的相互关系，为早期牙釉质龋病的预防和微创治疗提供一条新的研究思路。

1 釉质生物矿化过程的三个“关键事件”

釉质的仿生再矿化旨在体外模拟釉质天然发生过程，通过应用相关蛋白或其类似物，控制无定形矿物质前体在脱矿釉质表面有序沉积，最终所形成羟基磷灰石晶体结构同天然釉质相似，并具备接近的机械性能，以达到自下而上修复脱矿釉质的目的。因此，仿生再矿化的研究基础与釉质发生机制密切相关。

成熟的牙釉质为高度矿化的无细胞组织，其受外界或内源性因素受损后，除唾液提供的保护及再矿化潜力外，缺乏有效的生理手段进行修复。牙釉质的发育主要分为三个功能阶段：分泌前期、分泌期和成熟期[2]。在早期分泌阶段形成的釉质矿物主要是无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP），在釉质基蛋白（enamel matrix protein）的调控下，最终转化为羟基磷灰石晶体。釉质基蛋白是生物矿化的主要执行者，主要包括釉原蛋白、非釉原蛋白和釉质基蛋白水解酶。其中，釉原蛋白占釉质有机基质的90%以上，非釉原蛋白和釉质蛋白酶占10%左右。非釉原蛋白则主要包括釉蛋白、成釉蛋白、釉丛蛋白等。

目前已有研究证明，釉原蛋白，釉蛋白及两者间的相互协调作用对于控制釉质晶体形成至关重要[3]。经选择性敲除小鼠的蛋白基因后，可表现为不同程度的釉质发育不全，晶体走向混乱。此外，对于釉质蛋白酶缺失的小鼠，其牙釉质内有机基质将无法降解，致使所生成晶体的结晶度明显降低，这亦暗示了有机矿化模板的降解或是釉质晶体成熟的关键步骤[4]。

综上，牙釉质生物矿化似乎主要涉及了三个“关键事件”：（1）釉原蛋白模板和非釉原蛋白稳定的无定形磷酸钙在时间和空间上自组装，调控晶体的生长；（2）成熟期有机基质被降解，从细胞外空间被移除；（3）成熟后期，无定形磷酸钙向羟基磷灰石晶体转化，完成矿化。若能采用一种更趋近于天然的手段在体外模拟该三个“关键事件”，或可实现釉质受损区域快速高效的仿生修复。

2 釉质仿生再矿化

目前牙釉质仿生矿化主要围绕釉原蛋白仿生矿化展开，主要包括如下几个仿生策略：（1）体外合成全序列釉原蛋白或蛋白片段；（2）根据釉原蛋白调控介导矿化的机制，设计仿生多肽；（3）用其他聚合物仿生釉原蛋白调控矿化的功能。

2.1 釉原蛋白及其序列片段

2.1.1 重组釉原蛋白 釉原蛋白属于内在无序化结构蛋白，可与不同分子相互作用形成不同构象。在Ca2+和PO43-的参与下，自组装为纳米球（直径20～ 30 nm）的釉原蛋白有进一步多向延伸为富含淀粉样结构的链状、网状纳米纤维的趋势[5]。蛋白质淀粉样结构（amyloid）是蛋白质链解折叠单体再折叠时形成大量β-sheet 结构而产生的纳米纤维聚集体。在体外单独诱导重组全长釉原蛋白（rP172）能够促进细长棒状羟基磷灰石的形成，该现象表明釉原蛋白能够有效抑制晶体无规则的侧面延伸并促使其以c 轴方向优先生长[6]。

将rP172 与壳聚糖相结合制得水凝胶作用于釉质脱矿区域后，可形成约15 μm 的类釉质样结构，并与牙面紧密贴合[7]。但需要注意的是，该类釉质样结构的形成仅发生在釉原蛋白自组装和矿化（矿物离子掺杂）同时发生的条件下，预先组装釉原蛋白则不能达到该修复效果。此外，虽然rP172具有一定的釉质重建能力，但由于存在免疫原性，合成制备复杂，成本高等原因而限制了其在临床的应用。

2.1.2 釉原蛋白短片段多肽 鉴于釉原蛋白全长片段合成较为困难且非功能序列具有潜在免疫原性，近年开始采用选择性剪接釉原蛋白的主要功能段以合成短片段多肽TRAP 或LRAP，后者可替代全长蛋白在釉质仿生矿化中发挥作用，诱导无定形磷酸钙向有序晶体转化，形成类釉质样结构。

但TRAP 及LRAP 在体外尚不能实现釉质发生过程中的自组装行为，多以纳米球或无定形单体形式存在，与体内釉质有机基质中存在的交叉β-sheet 结构纤维状蛋白尚存在差距，无法作为有机模板引导有序晶体的大量形成[8]。

2.2 仿生多肽

仿生多肽旨在蛋白功能序列的基础上加以人为地设计或修饰，形成与原蛋白功能接近的小分子片段。其中，P11-4 被设计为具有大量β-sheet结构的功能肽，该多肽能够在特定因素触发下，自发性组装为纤维状三维支架以模拟基质内釉原蛋白的功能特性，这点对于实现釉质仿生再矿化具有重要作用[9]。除具备LRAP 的控制晶体取向及延伸功能外，P11-4 能够通过其表面带有的负电荷及磷酸化丝氨酸残基吸引聚集溶液内Ca2+，迅速恢复矿化所需离子浓度，从而促进脱矿釉质的修复。但由P11-4 诱导形成的晶体往往呈扇状排列，与水平排列的真实釉柱结构区别较大[10]。

鉴于釉原蛋白来源类多肽往往缺乏对于釉质的精确定位能力，近几年有研究尝试通过不同修饰以强化对于釉质的原位修复效果。通过将釉原蛋白C 末端氨基酸短序列经连接肽与无机结合肽HA6-1 结合后，可将修复作用位点有效定位在釉质表面，促使羟基磷灰石于脱矿区域有序沉积[11]。此外，经还原剂催化打开二硫键的溶菌酶可转变为含有大量β-sheet 结构的淀粉样蛋白（phasetransitioned lysozyme，PTL），对釉质形成有效铺展粘附[12]。PTL经釉原蛋白N端及中心区序列修饰后，通过模拟体内酶切后的釉原蛋白状态，可作为成核模板实现羟基磷灰石的合成，实现釉质的仿生再矿化修复。

2.3 聚合物

近年来，已有研究设计并研发了具有蛋白质类似功能的聚合物，以实现早期釉质龋的仿生预防及治疗。聚合物可通过模拟体内釉原蛋白对于无定形磷酸钙的稳定作用，实现釉质再矿化。聚（丙烯酸）（PAA）可在低分子量条件下螯合无机离子，形成稳定液相前驱体，并促进其转移致脱矿区域，实现晶体转化。当PAA 与作用机制接近的聚乙烯膦酸（PVPA）或三偏磷酸钠（STMP）相结合时，可产生协同作用进一步优化原有矿化作用，促使所形成晶体更为均匀且定向有序[13]。此外，与PAA 促矿化机制相接近的聚合物尚有聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯胺盐酸盐、聚赖氨酸及羧甲基壳聚糖等，均可通过稳定ACP 并促使其向晶体转化实现釉质的仿生矿化修复[14]。

而在最新研究中，鉴于聚酰胺胺树枝状聚合物（PAMAM）对于晶体的结合行为与釉原蛋白十分接近，能够组装呈类纤维带状结构，因此又将PAMAM 称为“人工蛋白”[15]。加载有羧基官能团（-COOH）的PAMAM-COOH 可作为脱矿质釉质表面的有机模板，提供成核位点，诱导与天然釉质具有相同结构和取向的羟基磷灰石晶体形成[16]。而PAMAM-PO3H2则具有与釉原蛋白相似的直径和功能，形成与釉质表面垂直且定向有序的棒状晶体，实现釉质原位矿化[17]。

3 总结与展望

综上所述，现有研究基本均是通过釉原蛋白、其衍生物或仿生物直接稳定无定形磷酸钙或与矿物离子相互作用，以获得类牙釉质晶体。但这些手段仍然无法在体外精准形成釉质的釉柱样结构，并将机械性能完全恢复至正常釉质水平。目前，釉质仿生矿化研究拟关注以下2 大方面：

3.1 重视釉原蛋白的淀粉样结构及模板功能

从体内釉质矿化的实际角度出发，只有P11-4低聚物具有淀粉样蛋白特征（含有β-sheet 结构），因此可在生理条件下于釉质龋损表层下自组装成纤维支架，并依赖对Ca2+离子较高的亲和力，促进矿物晶体成核启动矿化。而现有研究主要缺乏对釉原蛋白淀粉样纤维状态的仿生，未能突出釉原蛋白最主要的矿化模板功能。这种蛋白模板功能的缺失，或是目前无法完全重构有序排列的釉柱状结构的潜在原因之一。

3.2 重视非釉原蛋白、蛋白水解酶在釉质发生中的重要作用

对于釉原蛋白的酶解剪切过程仅有少数研究通过次氯酸钠或三乙醇进行模拟，目前对于仿生牙釉质生物矿化中水解蛋白酶作用的阐述仍较为匮乏[18]。而对于非釉原蛋白，例如釉蛋白，虽然对于ACP 的稳定及成核均有不容忽视的作用，但对该蛋白的仿生还未引起重视。最近有学者尝试利用聚天冬氨酸来仿生釉蛋白，基于聚合物诱导液相前驱体机制去稳定ACP，并作用于脱矿的釉原蛋白纤维支架，使其重新矿化。目前大多数的研究尚集中于利用酸性聚电解质以仿生釉原蛋白功能，但其实后者并不是典型的酸性蛋白。

此外，目前所应用的仿生途径并不能完全模拟釉原蛋白、非釉原蛋白及矿物之间在时间及空间上的同步组装行为，这或许也是无法在体外完全形成釉质釉柱样结构的关键难点。

因此，仿生矿化的研究尚需进一步关注釉质发生三个“关键事件”，重视釉原蛋白的矿化模板功能以及非釉原蛋白及水解酶在矿化过程中的作用，从而以最接近天然发生的形式快速有效地修复脱矿釉质，达到有效预防并治疗早期釉质龋的目的。