高 莉，孙云鹏，霍仕霞，阿娜尔·马木提，买买提·艾力，闫 明

(新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，新疆维吾尔自治区维吾尔医方剂学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)

阿纳其根是罗马除虫菊Anacycluspyrethrum(L.)DC.(AP)的根，干热、味辛辣而麻舌，具有祛寒强筋、开通阻滞、通利经水、滋补神经等功效[1-2]，主要用于治疗白癜风、肿瘤、膝骨关节炎等疾病[2-4]，主要分布于北非和欧洲南部，我国新疆有少量的野生资源分布。阿纳其根主要含有黄酮类、挥发油类、N-烷基类、香豆素类等化学成分[5]，黄酮类被认为是其主要活性成分之一，具有抑制肿瘤细胞增殖[3]、酪氨酸酶激活[6]、保护神经细胞[7]和调节情绪[8]等功效。目前，阿纳其根的研究报道主要为对其化学成分分析和药效作用的评价方面，而对于其总黄酮类成分提取及作用机制方面报道甚少。

响应面设计法是可靠的实验设计及分析方法，可通过过程的回归拟合计算出响应于各因素水平的响应值，在提取试验中往往能够得到最优工艺参数，是解决多变量问题的一种有效统计方法[9-10]。本研究根据单因素试验的结果，采用响应面法进一步优化乙醇提取阿纳其根总黄酮的提取工艺，同时，基于前期研究发现的其具有改善冈田酸(okadaic acid，OA)对PC12细胞损伤的作用基础上[7]，探讨阿纳其根总黄酮是否通过抑制Tau蛋白过度磷酸化作用起到细胞保护作用，为阿纳其根进行更深入的研发和应用提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

芦丁标准品(纯度>99%，上海源叶生物科技有限公司)；阿纳其根(新疆麦迪森维药有限公司)；(+)-儿茶素、福林酚/Folin&Ciocalteu’s phenol reagent、无水碳酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、硝酸铝、石油醚(沸程60-90℃)、浓盐酸、亚硝酸钠(均为国产分析纯)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Thermo公司)；一抗Tau(p ser-396)、Tau(p ser 199/202)、Tau(p Thr231)(美国Abcam公司)；二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 试验仪器

调温电热套(DZTW型，北京市永光明医疗仪器有限公司)；电子分析天平(SQP型，德国赛多利斯)；恒温水浴锅(XMTD-7000型，北京市永光明医疗仪器有限公司)；酶标仪(Go 1510型，美国Thermo Fisher)；旋转蒸发器(RE-52AA型上海亚荣生化仪器厂)；循环水式多用真空泵(SHB-BA95型，巩义市英峪予华仪器厂)；数控超声波清洗器(KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司)；垂直电泳仪(125-BR型，美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(Gel Doc XR型，美国Bio-Rad公司)；高速冷冻离心机(Allegra 64R型，德国Benkman公司)。

2 试验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称量干燥恒重芦丁5 mg，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL，得到浓度为0.05 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准品溶液至25 mL容量瓶中，加70%乙醇至10 mL，然后分别加入5%亚硝酸钠溶液0.7 mL，混匀静置6 min后，各加入10%硝酸铝溶液0.7 mL，摇匀后静置6 min。最后加入4%氢氧化钠溶液4 mL，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，静置15 min。检测不同浓度标准品510 nm波长处的吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得回归方程为：A=0.1218C+0.0006，R2=0.9976；A为吸光度，C为芦丁的浓度(mg/mL)。

2.2 阿纳其根总黄酮的提取及得率测定

精密称取干燥的药材粗粉2 g，加入70%乙醇溶液20 mL，浸泡12 h，80℃水浴，回流提取2 h，提取2次，减压抽滤，合并滤液，于70℃条件下减压浓缩，干燥，称重。准确称取样品20 mg，加70%的乙醇溶液50 mL。取样品溶液5 mL，置于25 mL容量瓶中，按2.1方法操作，测定样品吸光值，按照公式(1)计算黄酮得率。

黄酮得率(mg/g)=C×5×V/M

(1)

式中：C为回归方程计算的样品黄酮含量，(mg/mL)；5为测定用样品体积，mL；V为样品总体积，mL；M为阿纳其根质量，g。

2.3 单因素试验设计

精密称取药材粗粉2g，其他条件固定不变，分别对液料比、提取时间、提取次数、提取温度、乙醇浓度5个因素进行单因素试验。液料比分别为6∶1、8∶1、10∶1、12∶1；提取时间分别为1、2、3、4 h；提取次数分别为1、2、3、4次；提取温度分别为60℃、80℃、100℃；乙醇浓度分别为60%、70%、80%、90%；然后减压抽滤，浓缩，干燥，称重。按2.2项下方法进行测定，依据回归方程计算总黄酮含量。

2.4 响应面试验设计

根据单因素试验结果，选择乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、液料比(D)为自变量，阿纳其根总黄酮含量(Y)为响应值，采用4因素3水平的响应面法进行试验，因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平

2.5 阿纳其根总黄酮对OA损伤PC12细胞存活率的影响

取对数生长期PC12细胞，接种于96孔培养板培养48 h，设空白组、对照组、模型组和阿纳其根总黄酮给药组(2.5、5.0、10.0 mg/mL)，每组设6个平行孔。空白组(不含细胞)加入等体积不含OA的PBS溶液，对照组加入等体积不含OA的培养液，模型组和给药组加入含有20 nmoL/LOA1640培养基，37℃温育24 h后吸弃培养基，给药组再加入含有不同浓度阿纳其根总黄酮(2.5、5.0、10.0 mg/mL)的培养基(空白组加入等体积PBS溶液，对照组及模型组加入同体积细胞培养液)，然后继续培养24 h后，空白组每孔加入20 μL PBS溶液，其余各组每孔加入20 μL(5 g/L)的MTT，反应4 h，吸出溶液，空白组每孔加入100 μL PBS溶液，其余各组每孔加入等体积DMSO，震荡混匀，在酶标仪490 nm波长处检测吸光度值[11]。细胞存活率(%)=(加药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

2.6 阿纳其根总黄酮对OA损伤PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化的影响

用24孔细胞板培养细胞，每组设3个平行孔，同1.6的方法造模、给药后，吸弃培养基，加入PBS将细胞吹打下来，混悬，1000 r/min离心10 min，用PBS反复洗2次，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。用5% 浓缩胶和10%分离胶电泳，湿转，封闭。一抗(1：1000)4℃孵育过夜，1×TBST震荡洗涤3次，二抗(1：3000)孵育1h，1×TBST洗涤3次。避光，加入现配发光液，曝光，照相，用软件定量分析。

2.7 数据处理

3 结果与分析

3.1 单因素试验

从图1(A)可见，在液料比为8∶1～14∶1范围内，随着乙醇用量的增加，总黄酮得率逐渐提高，在液料比为12∶1时趋于平缓，故选择料液比8∶1～12∶1进行响应面优化分析。从图1(B)可见，在提取时间为60～100 min范围内，随着提取时间延长，总黄酮得率先提高后降低，于2 h时最高，故选取提取时间1～3 h 进行响应面优化分析。从图1(C)可见，在提取次数为1～4次范围内，随着提取次数增加，总黄酮得率先增大后减小，于提取2次时最大，故最终确定最佳提取次数为2次。从图1(D)可见，在乙醇浓度为60%～90%范围内，随着乙醇浓度升高，总黄酮得率先增大后减小，乙醇浓度为70%时，总黄酮的提取效果最好，故选择乙醇浓度60%～80%进行响应面优化分析。从图1(E)可见，在提取温度为60～100℃范围内，总黄酮得率呈现先升后降的趋势，于提取温度为80℃时达到最高，之后有所下降，故选取提取温度为70～90℃进行响应面优化分析。

图1 单因素试验结果

3.2 响应面试验结果

3.2.1 响应面试验设计及结果

综合单因素结果，按照表1的因素与水平设计响应面试验，响应面分析结果见表2。由表2可以看出，各因素的中心点试验阿纳其根黄酮含量值均高于析因点试验，与单因素试验结果相符，说明该响应面设计的29个试验点可信度较高。

表2 Box-Behnken试验设计及结果

3.2.2 回归方程的建立及方差分析

Design-Expert软件对试验所得数据进行方差分析和多元二次回归拟合，见表3。

表3 阿纳其根醇提物总黄酮提取回归模型的方差分析

由方差分析结果可知，推测影响提取率因素为A> C> D> B，模型P<0.01，表明响应面回归达到极显著水平，模型回归显著可靠，A、C、D因素对阿纳其根黄酮得率的影响极显著(P<0.01)。同时，A的平方项对阿纳其根总黄酮得率的影响极显著，C和D的交互作用以及C和D的平方项对阿纳其根总黄酮得率影响显著，说明A、C和D对阿纳其根总黄酮得率的影响不是简单的线性关系，平方项和交互项也有很重要的作用，这与模型分析的结果相符；失拟项P=0.0633>0.05，表明实验以外的其他因素对本实验的影响小；模型的R2为 97.63%，接近1，证明试验数据较可靠，该模型拟合度较高，可以用于乙醇提取阿纳其根总黄酮的理论预测。

3.2.3 响应面分析

分别以A、B、C和D为响应因子，由回归方程得出对应的响应面分析图和等高线分析图，直观分析各因素交互作用对阿纳其根醇提物总黄酮率的影响。

乙醇浓度与提取时间、提取温度和液料比的交互作用对阿纳其根总黄酮提取率的影响如图2(A)、2(B)、3(C)所示，乙醇浓度在60%～65%时，阿纳其根总黄酮提取率逐渐增高，乙醇浓度超过65%时，总黄酮提取率随乙醇浓度降低而减少，固定乙醇浓度时，总黄酮提取率均随提取时间、提取温度和液料比的增大而增加；提取时间与提取温度和液料比的交互作用对阿纳其根总黄酮提取率的影响如图2(D)、2(E)所示，固定提取时间时，总黄酮提取率随提取温度和液料比的增大而增加，而固定提取温度和液料比时，总黄酮提取率随提取时间的变化不明显；提取温度与液料比的交互作用对阿纳其根总黄酮提取率的影响如图2(F)所示，固定提取温度时，总黄酮提取率随液料比的增大而增加，而固定液料比时，总黄酮提取率随提取温度的升高而明显增加。图2(B)、2(C)、2(F)对响应面坡度影响最大，说明乙醇浓度与提取温度、料液比对总黄酮的提取影响较大。

图2 不同影响因素交互作用的响应面图(左侧)和等高线图(右侧)

3.2.4 最佳工艺条件的确定及验证试验

根据响应面图直观分析，由Design-Expert软件分析出醇提法提取阿纳其根总黄酮的最佳提取条件为提取温度87.93℃、乙醇浓度64.46%、液料比11.79 mL/g、提取时间62 min，回归方程预测值为11.0458 mg/g。为了验证该方法的可行性，结合实际的操作情况，在提取温度90℃、乙醇浓度为65%、提取时间为60 min、液料比12 mL/g 的条件下重复3次试验，得到阿纳其根总黄酮含量为(11.66±0.12)mg/g，与方程预测值相吻。

3.3 阿纳其根总黄酮对冈田酸损伤PC12细胞存活率的影响

由图3可见，与对照组细胞相比，模型组PC12细胞经20 nmoL/L冈田酸损伤24 h后，细胞存活率显著降低，模型组存活率仅为(61.06±4.07)%(P<0.01)。与模型组相比，阿纳其根总黄酮各给药组能够明显改善冈田酸损伤PC12细胞的现象，显著提高细胞存活率(P<0.01)，并呈现剂量依赖性。

图3 阿纳其根总黄酮对冈田酸损伤的PC12细胞存活率的影响

3.4 阿纳其根总黄酮对冈田酸损伤PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化的蛋白表达检测

由图4可见，与对照组相比，模型组细胞Tau蛋白ser-199/202、ser-231和 ser-396位点磷酸化的表达水平明显升高(P<0.01)。与模型组相比，阿纳其根总黄酮各给药组细胞Tau蛋白这四个位点的磷酸化表达水平均呈现不同程度的降低，尤其10.0 mg/L剂量组显著减少Tau蛋白这四个位点的磷酸化表达(P<0.05，P<0.01)，其中阿纳其根总黄酮对Tau蛋白ser-199/202这个位点的作用最强，在5.0 mg/L剂量时就能明显降低其磷酸化表达水平(P<0.05)。

图4 阿纳其根总黄酮对冈田酸损伤的PC12细胞Tau蛋白磷酸化的影响

4 讨 论

由Design-Expert响应面优化得出最佳条件并按实际操作情况修改的提取阿纳其根总黄酮工艺为提取温度90℃、乙醇浓度65%、液料比12 mL/g、提取时间60 min。在此工艺条件下，阿纳其根醇提物总黄酮得率预测值为11.05%，验证值为11.66%，与预测值的相对误差为0.61%。

前期研究报道阿纳其根醇提物对记忆障碍小鼠有改善学习记忆的作用[12]，以及调节冈田酸损伤的PC12细胞周期和抑制细胞早期凋亡的作用[7]，但其作用机制不清楚。冈田酸能够促使神经元微管相关蛋白Tau蛋白过度磷酸化，而这种现象与神经元变性、神经细胞突触减少以及机体的记忆障碍相关[13]。结果显示，在此工艺下获得的阿纳其根总黄酮，在2.5～10.0 mg/mL剂量范围内对冈田酸损伤的PC12细胞具有明显的改善作用，提高细胞存活率，而在10.0 mg/mL 剂量时能够显著降低冈田酸诱导的Tau蛋白在ser-199/202、ser-231和ser-396位点磷酸化水平增高，表明阿纳其根对冈田酸诱导PC12细胞Tau蛋白过度磷酸化具有明显的抑制作用，提示其保护神经细胞的作用与其具有调节微管相关蛋白稳定性，起到维持细胞骨架和细胞形态作用，从而达到提高神经细胞的存活率和保护细胞的作用有关。

综上所述，阿纳其根总黄酮得率响应方程的回归分析和验证试验表明，此方法合理可行，利用响应面法得到的阿纳其根醇提物总黄酮提取工艺参数真实有效，这是首次对阿纳其根醇提物总黄酮提取的工艺优化，具有参考价值。阿纳其根总黄酮能够抑制冈田酸致PC12细胞Tau蛋白的过度磷酸化，具有促进Tau蛋白去磷酸化的作用，为其进一步的研发和应用提供了实验数据。