韩超逸，汤德元，曾智勇，黄 涛，王 彬，郭倩妤，廖少山，张 森，杨志刚，晏仁潭

(贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种人畜共患的蚊媒传染病。JEV为黄病毒科，黄病毒属，单股正链RNA病毒。JEV可感染人、马、猪、水禽等多种动物，其中猪是其扩大宿主，人为其终末宿主[1]。JEV感染人可引起病毒性脑炎，死亡率达25%～30%，50%的存活者会留下永久性的中枢神经系统损伤后遗症，如认知障碍、行为紊乱、失忆[2]。JEV感染猪可引起怀孕母猪流产，产木乃伊及死胎，公猪发生睾丸炎精液品质下降，对猪业养殖造成巨大经济损失[3]。目前，JE并无特效治疗药物，控制JEV最有效的手段是接种疫苗。

1 JEV致病机制

JEV感染宿主后，可在淋巴结和外周组织中扩增造成一定的损伤[4-5]，并且JEV可损伤DCs功能，从而抑制CD4+T和CD8+T细胞发生免疫应答，促进JEV在体内扩散[6]，JEV在体内扩散后可通过血脑屏障进入中枢神经系统，感染神经元细胞，被感染的神经元细胞释放促炎因子和趋化因子，这些促炎因子和趋化因子可活化小胶质细胞产生更多的炎症因子，并且JEV也可直接感染小胶质细胞促进炎症因子的释放[7]，中枢神经系统中炎症因子和趋化因子的增加，可募集外周免疫细胞进入中枢神经系统，再次分泌大量细胞因子和趋化因子，如此循环反复导致了中枢神经系统中“炎症风暴”的发生，这也是导致神经元死亡的主要原因[8]。

2 JEV进入中枢神经系统途径

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是由脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元细胞构成的一道位于外周循环系统和中枢神经系统之间的屏障[9]。BBB是一种选择透过性屏障，其既可以阻挡病原体和有害物质，又严格控制着血液和脑内的物质交换，保护中枢神经系统不受侵害，维持脑内微环境平衡[10]。

病原体进入中枢神经系统有4种途径：跨神经途径，一些疱疹病毒可通过鼻腔感染嗅神经元，病毒粒子进入嗅球之后感染胶质细胞可引发病毒性脑炎[11]；跨细胞途径，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)可通过血管内皮细胞间隙进入中枢神经系统，整个过程并不破坏BBB[12]；细胞旁路途径，西尼罗病毒(WNV)可感染血管内皮细胞破坏BBB，进入脑内引起脑部病毒性炎症[13]；特洛伊木马途径，人免疫缺陷病毒(HIV)可感染T细胞，当携带HIV的T细胞通过BBB时可将HIV带入大脑[14]。

崔宁一[15]通过足垫注射使小鼠感染JEV，7 d后分离小鼠的脑、嗅球和脊髓检测JEV含量，发现在小鼠脑中检测到JEV，但脊髓和嗅球均未检测到JEV，表明在小鼠模型中JEV并未通过跨神经途径进入中枢神经系统。进一步研究发现，JEV可感染CD3+T细胞、CD19+B细胞和Ly6c+单核细胞，分离感染JEV小鼠的脾脏细胞与内皮细胞互作，发现内皮细胞上黏附了大量单核细胞，原因是JEV感染上调了单核细胞LFA-1、VLA-4黏附分子，以及内皮细胞上相应配体ICAM-1、VCAM-1的表达，增强了内皮细胞与单核细胞的黏附作用。JEV对单核细胞及内皮细胞黏附因子及配体的上调，增强了单核细胞与内皮细胞的黏附作用，为JEV以特洛伊木马途径通过BBB进入大脑提供了理论支持。

3 JEV感染引起BBB受损

在脑部受到重创或病原体侵入时，BBB完整性和功能会遭到破坏，除此之外花生四烯酸、组胺等化学物质也可破坏BBB。BBB受损会导致中枢神经系统失去保护，引起多种神经系统疾病，在阿兹海默症、中风、帕金森等多种疾病中都发现BBB完整性被破坏。紧密连接是BBB细胞之间的一种连接方式，对于维持BBB完整性有重要意义。紧密连接蛋白包括：咬合蛋白(occludin)、闭合蛋白(claudins)、连接黏附分子(junction adhesion molecules,JAMs)，闭合小环蛋白(zona occludin,ZO)可以将咬合蛋白和闭合蛋白连接在内皮细胞骨架上[16]。当紧密连接蛋白occludin、claudin-5、ZO-1表达量及分布发生变化时，就意味着BBB的通透性和功能发生了变化[17]。

LI等[18]发现JEV进入大脑发生在BBB通透性增加之前，在JEV感染的小鼠大脑中，occludin、claudin-5、ZO-1表达量下降79.63%，56.65%和65.35%，表明JEV感染小鼠增加了BBB通透性。但使用JEV直接感染内皮细胞发现occludin、ZO-1表达并无变化，而使用感染JEV小鼠的脑提取物处理内皮细胞，发现2种蛋白表达显著降低，表明JEV并非增加BBB通透性的直接原因，而是JEV感染所产生的炎性因子通过破坏BBB紧密连接，增加了BBB通透性。进一步研究发现，JEV感染注射抗IFN-γ抗体的小鼠与JEV感染小鼠相比，BBB受损程度减轻，表明抑制IFN-γ在JEV感染过程中对BBB有保护作用，IFN-γ可能是治疗乙脑的潜在靶点。

娄文娟[19]发现JEV P3株可活化内皮细胞，降低内皮细胞的早期和晚期凋亡，上调黏附分子配体ICAM-1的表达。为探究JEV-P3株活化内皮细胞是否破坏其细胞屏障功能，使用ECIS检测JEV P3株感染内皮细胞后，内皮细胞的细胞电阻值及Rb值是否发生变化，发现JEV P3株感染内皮细胞后，电阻值及Rb值并未发生变化，证明JEV P3株感染内皮细胞并未破坏细胞屏障功能以及细胞间连接，而使用发病小鼠脑上清处理内皮细胞，其电阻值及Rb值显著下降，证明小鼠脑上清中含有的炎症因子破坏了内皮细胞的屏障功能和细胞间连接。内皮细胞活化可黏附免疫细胞，使用ECIS检测与JEV P3株处理脾脏细胞互作的内皮细胞电阻值及Rb值，发现内皮细胞黏附免疫细胞并不改变内皮细胞的屏障功能和细胞间连接，该研究证明JEV P3株可活化内皮细胞但其并不影响其屏障功能及细胞间连接，进一步探究了JEV的致病机制。

WANG等[20]研究发现JEV感染小鼠过程中趋化因子IP-10一直维持高表达，是JEV感染中变化最早最显著的趋化因子。中和IP-10可缓解JEV感染小鼠引起的BBB紧密蛋白变化，对BBB产生保护作用。但使用IP-10直接作用于内皮细胞并不会破坏其完整性，表明趋化因子IP-10不能直接破坏BBB，进一步研究发现IP-10与其受体CXCR3结合后，可激活星形胶状细胞MAPK信号通路，磷酸化的c-Jun N-末端激酶(JNK)可诱导下游早期转录因子c-Jun磷酸化，上调TNF-α的表达。TNF-α可下调occludin、claudin-5和ZO-1 3种蛋白的表达，并引起ZO-1向胞质转位，破坏BBB的完整性。该研究阐明了在JEV感染过程中高表达的趋化因子IP-10诱导下游TNF-α产生破坏BBB的机制，揭示了JEV感染引起BBB受损的新途径。

4 JEV感染引起细胞凋亡

细胞凋亡是细胞在遇到外界刺激后为维持内环境稳态而发生的一种由基因控制的程序性死亡[21]。细胞凋亡途径包括：死亡受体介导凋亡、细胞线粒体介导凋亡以及内质网应激介导凋亡。很多病毒感染细胞都可以引起细胞凋亡，如与JEV同属黄病毒科的2型登革热病毒(DENV2)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)均可诱导细胞凋亡[22-23]。对于宿主细胞而言凋亡可以限制病毒在体内的扩散，对于病毒而言凋亡的发生有利于病毒的释放，而凋亡的抑制可增加病毒在细胞内的感染时间，利用宿主细胞产生更多的病毒粒子[24]。

内质网是真核生物中重要的细胞器，具有蛋白加工、维持钙离子平衡、脂类代谢的功能[25]。当内环境稳态发生变化或病原体感染时会引起内质网功能紊乱，导致内质网应激。内质网应激可触发由跨膜蛋白激酶1(IRE1)、活化转录因子6(ATF6)、双链RNA活化蛋白激酶样ER激酶(PERK)共同调控的非蛋白折叠反应[26]。非蛋白折叠反应可缓解一定程度的内质网应激，恢复内质网正常功能，但持续性的内质网应激时，IRE1、ATF6、PERK会激活下游的C/EBP同源蛋白(CHOP)、JNK、Caspase-12触发细胞凋亡[27]。

HUANG等[28]发现JEV感染BHK-21细胞可上调GRP48、ATF6、ATF4的转录水平，引起内质网应激。内质网应激可激活IRE1切割XBP1 mRNA，产生XBP1-s mRNA编码具有转录活性的XBP1-s蛋白。XBP1和ATF6可促进下游CHOP蛋白表达引起细胞凋亡，使用Western blot检测JEV感染BHK-21细胞GRP78、CHOP、ATF6蛋白表达水平，发现JEV感染可上调3种蛋白表达。使用IRE1抑制剂和JNK抑制剂处理细胞后能显著的减少CHOP、Caspase-3、IRE1蛋白表达，抑制JEV引起的细胞凋亡，并且2种抑制剂不影响JEV复制，证实JEV可通过IRE1/JNK信号通路诱导BHK-21细胞凋亡；表明JEV引起的内质网应激是JEV致病过程中引起神经元死亡的重要原因，为乙脑的治疗和药物的研发提供了新的思路和靶点。WANG等[29]发现JEV感染Neuro-2a细胞和小鼠后，体内外磷酸化PERK和eIF2α的表达均升高及ATF4、CHOP蛋白上调，引起细胞凋亡。使用PERK抑制剂处理细胞，可抑制PERK和eIF2α的磷酸化及ATF4、CHOP蛋白表达，显著减少JEV引起的细胞病变和凋亡，表明JEV可通过激活PERK-ATF4-CHOP途径引起细胞凋亡。并且JEV非结构蛋白NS4B 可通过其LIG-FHA和LIG-WD40域与PERK相互作用，可促进PERK发生二聚化激活PERK，向小鼠颅内注射表达NS4B的质粒，可激活PERK促进脑细胞凋亡及诱发脑炎。WANG等[29]揭示了JEV非结构蛋白NS4B与宿主细胞互作诱导细胞凋亡的机制，为JEV的治疗提供了新的方向和理论支持。

p53是一种转录因子，磷酸化的p53进入细胞核可启动与细胞生长和凋亡有关的基因转录。p53可通过死亡受体途径、线粒体途径，诱导细胞凋亡。邓绪芳[30]研究发现，p53可抑制JEV复制，JEV感染细胞可引起p53转录水平下降，降低细胞内p53蛋白水平。JEV感染转染p53 siRNA的细胞，细胞凋亡率相对于转染NC siRNA组要高出3.4%，表明JEV引起的细胞凋亡不依赖p53。进一步研究发现细胞缺失p53可上调Xaf1表达，p53基因敲除小鼠脑组织Xaf1表达水平是野生型小鼠的89倍，Xaf1可通过抑制Xiap增加Caspases的活性促进细胞凋亡。以上结果表明，JEV感染p53基因缺失细胞增加细胞凋亡比例，其原因可能为p53基因缺失，可促进JEV复制感染更多的细胞，增加细胞凋亡；p53基因缺失可上调Xaf1表达促进细胞凋亡。邓绪芳[30]发现了p53在JEV感染过程中的生物学功能，JEV通过抑制p53增加病毒增殖，促进细胞凋亡增强其致病力。

叉头框转录因子家族O亚族(FOXO)是一类在生物活性中具有重要功能的转录因子，参与细胞生长代谢、分化、氧化应激、DNA损伤修复、肿瘤发生、细胞凋亡等。GUO等[31]发现沉默FOXO可促进JEV引起的细胞凋亡，而过表达FOXO可抑制JEV引起的细胞凋亡，但FOXO含量变化对JEV复制并无影响。JEV感染Neuro-2a细胞可下调细胞内FOXO以及FOXO信号通路下游的抗凋亡蛋白Bcl-6、p21的mRNA含量，细胞过表达FOXO后，Bcl-6、p21表达升高，JEV感染过表达FOXO的细胞，细胞凋亡比率降低。以上结果表明，JEV感染Neuro-2a细胞后，可通过下调FOXO信号通路中的Bcl-6和p21的表达，诱导细胞凋亡。进一步研究发现，FOXO启动子区域可与STAT3结合，JEV感染细胞可降低STAT3蛋白表达，抑制STAT3与FOXO启动子结合，降低FOXO表达。表明JEV感染Neuro-2a细胞可通过抑制STAT3蛋白表达降低STAT3与FOXO启动子结合，下调FOXO表达导致FOXO信号通路下游抗凋亡蛋白p21和Bcl-6表达减少，诱导Neuro-2a细胞凋亡。该研究发现JEV可通过抑制STAT3-FOXO-Bcl-6/p21信号通路诱导细胞凋亡，不仅揭示了新的JEV致病分子机制，也为JE药物的研发提供了新的思路和靶点。

5 小结

JEV是一类危害人类健康和猪业养殖业的重要病原体，可通过蚊虫为媒介传播。JEV感染中枢神经系统引起病毒性脑炎以及神经细胞的大量死亡，是JEV最重要的致病机制。感染中枢神经系统第一步就是要跨过BBB，以目前的研究结果来看在小鼠模型中跨神经途径并不是JEV进入中枢系统的途径，而JEV可感染免疫细胞以及上调免疫细胞黏附分子，内皮细胞相应配体的表达，为以特洛伊木马途径进入中枢神经系统提供了依据。JEV感染可引起BBB受损，但很多研究表明[18-20]JEV并不是破坏BBB的直接原因，JEV感染内皮细胞并未破坏细胞屏障功能以及细胞间连接，而JEV感染所产生炎性因子和趋化因子如：IFN-γ、TNF-α，可破坏BBB的完整性和功能。对于JEV感染引起的细胞凋亡，一些研究表明[28-29]JEV感染可引起内质网应激，激活IER1/JNK、PERK-ATF4-CHOP信号通路诱导细胞凋亡。除此之外，FOXO、p53转录因子在JEV诱导细胞凋亡中有着重要作用，2种转录因子的沉默均可增加JEV引起的细胞凋亡，而JEV感染可引起2种转录因子的下调诱导细胞凋亡[30-31]。对JEV感染中枢神经系统过程中，跨越BBB的途径，引起BBB损伤，诱导细胞凋亡的研究进行总结论述，为JEV的致病机制研究提供参考，以及为JEV药物的研发提供新的思路。