施季森

(南京林业大学林木遗传与生物技术教育部重点实验室, 南京林业大学林学院,南方现代林业协同创新中心, 江苏 南京 210037)

《CRISPR/Cas基因组编辑》因获2020年诺贝尔化学奖而再度引起广泛关注。自1970年报道基因编辑小鼠以来，约有33 850条文献涉及基因编辑(据ScienceDirect)。2012年CRISPR/Cas9技术突破后的文献占98.32%，其中涉农、林植物基因(组)编辑文献占10.63%，林木CRISPR/Cas9基因组编辑研究也迅速起步。应编辑部之约，特付短评一二，供参考。

1 林木跨入基因(组)编辑时代

木本植物虽受个体高大、生命周期长、基因组复杂等生物学特性所限，CRISPR/Cas9技术的突破，林木基因组编辑研究发展迅速。2015年，有关采用CRISPR/Cas9系统研究杨树木质素合成通路4CL:CoA连接酶[1-2]、毛白杨PtoPDS光合作用[3]等基因功能研究的报道，开启了林木基因组编辑研究新篇章。

本专题中侯静等[4]介绍了CRISPR/Cas技术的发展及其在林木改良中的应用前景，为木本植物基因组编辑和应用提供了重要参考。该文成稿后，又有麻竹[5]、油棕[6]、椰枣[7], 毛果杨[8]、山银杨杂交种[9]、银白杨[10]、杂交杨84K无性系[11]、橡胶树[12]、茶树[13]，日本柳杉[14]、辐射松[15]和白云杉[16]等树种基因组编辑研究取得新进展，分别涉及生长、材性、抗逆性和次生代谢物等重要性状。尤其是，张金凤课题组及其合作团队[16]基于CRISPR/Cas9系统和体胚发生植株再生技术平台，同时实现白云杉PgDXS1基因有效编辑和突变株体胚再生技术的路线，不但对基因组超大、植株再生困难的针叶树种，而且对其他木本植物的基因组编辑研究，均提供了参考。

本专题中王竹雯等[17]、孙佳彤等[18]则基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，解析毛果杨(Populustrichocarpa)PtrHBI1基因[17]和bHLH106转录因子[18]在毛果杨营养生长、次生木质部发育以及细胞壁木质素和纤维素组分变化等方面的功能及其调控作用。发现PtrHBI1基因和bHLH106转录因子对杨树生长、木质部形成层发育、细胞壁纤维素含量和木质素S/G组分变化等经济性状均有重要影响。该团队今年还报道了CRISPR/Cas9系统研究毛果杨PtrLBD39基因在应拉木形成调控网络的重要进展[8]。所有这些研究，为林木基因组编辑、基因功能、种质创新和基因组选择育种研究提供了重要参考。

2 CRISPR/Cas技术简史和未来发展趋势

2.1 简史

数十年来，科学家一直努力开发经济、高效、可靠，能精准编辑基因组的新一代基因工程技术。20世纪70年代基因工程小鼠的成功[19]，催生了动植物基因编辑研究热潮。然第1代基因编辑技术不能进行精准靶向编辑而受限，全世界科学家多路并发专注于精准靶向基因组编辑技术研发。1987年Ishino等[20]发现古细菌基因组中存在CRISPR结构后的20多年中，先后统一了CRISPR/Cas命名，提出了CRISPR/Cas假设，证实了CRISPR/Cas源自古细菌适应性演化中获得天然抗病毒免疫系统。CRISPR/Cas基因系统树为两支6亚型，一支为亚型Ⅰ(Cas3)、Ⅲ(Cas10)和IV(Sef1)；另一分支为亚型Ⅱ(Cas9、Cas1、Cas2和Cas4)，Ⅴ(Cas12)和Ⅵ(Cas12)。2012年，CRISPR/Cas基因编辑技术有了颠覆性重大突破，功能强大、省时省力基因组编辑器CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9的问世[21-22]，带动了生物CRISPR/Cas系统基因编组辑技术和应用研究的快速发展。

2.2 发展趋势

CRISPR/Cas基因编辑技术由单纯的基因插入/缺失，已发展成为精准全基因组DNA单碱基替换、特定或成串基因序列插入或缺失、表型组修饰，以及不同RNA功能模块(化)搭建等一系列基因组水平精准高效靶向遗传操作工具[23]，但面对众多生物种类或不同改良目标，现有CRISPR/Cas工具在靶向和编辑效率等方面仍不能满足基础和应用研究的需要。当前，基因组编辑研究大体围绕两方向展开。

1)基因组编辑器研发。以开发或完善编辑工具为主要目标。随着生物基因功能、基因编辑机理及其互作网路的深入解析，CRISPR/Cas基因(组)编辑“工具箱”不断更新扩充。在单位点(singal locus)编辑技术体系基础上，发展出了多位点(multiplex loci)基因编辑技术体系，如sgRNA-CRISPR/Cas9[22,6]，最近陆续报道了Cas13、Cas12a、Cas12f(Cas14)、Csm6等基因组编辑工具[23-24]。针对模型动物和医学上，基因编辑多基于腺病毒(AAV)载体运送基因的特点，CRISPR系统趋向Mini化[25]。同时有学者指出，Mini 型CRISPER/Cas12f1基因编辑系统也适用于在植物上应用[26]。当然，对于Mini型基因组编辑工具是否更适合在木本植物上应用，还有待进一步深入研究。

2)CRISPR/Cas基因组编辑技术体系应用。植物应用方面，有两条不同技术路线在不同团队间竞发。一些团队侧重于单碱基替换或突变、短序列功能片段编辑技术路线的应用；另一些则强调长片段序列应用的重要性。这两条技术路线的应用，在植物上均取得了显著的进展。笔者认为，当前虽然有一些不同的观点，但随着基因组编辑技术的进步，以及不同物种、性状、层级调控网络功能等问题的深入解析，无论是单位点还是多位点基因组编辑技术路线，终将走向融合，在不同物种、性状、遗传背景和代谢途径等不同层级的基因组编辑方面发挥优势。

综上，基因编辑研究和应用，由“盲盒”试错之路逐渐走向“精准靶向”时代。但在林木上仅偏重于现有技术的应用，林木基因编辑器的研发基本上为空白。在CRISPR/Cas基因组编辑系统，尤其是具有不同功能或功效、适合于不同物种或不同改良性状靶标的CRISPR/Cas变异体(variants)开发，仍是未竟之路。正如CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系的奠基人指出的那样：已开发的CRISPRs基因编辑工具或许只是“冰山一角”，在CRISPR/Cas核酸酶结构域这一基因编辑“武器库”阵列中，又发现了一类短氨基酸序列IscB和TnpB 蛋白，有可能成为下一代基因组编辑新的强力工具[27]。我们期待高效简化基因编辑新工具，也期待在林木多位点基因组编辑技术研发和应用方面也有所作为。