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管氏肿腿蜂毒液丝氨酸蛋白酶同源物SgSPH对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响

2021-04-13李丽芳吴朝妍韩开健吴国星朱家颖

昆虫学报 2021年2期
关键词:寄生蜂氧化酶毒液

李丽芳, 吴朝妍, 韩开健, 吴国星, 朱家颖,*

(1. 西南林业大学, 云南省森林灾害预警与控制重点实验室, 昆明 650224;2. 云南农业大学植物保护学院, 昆明 650201)

毒液作为寄生蜂的关键寄生因子之一,具有调控寄主生长发育、抑制寄主免疫反应、影响寄主营养代谢等生理功能,在寄生蜂与寄主互作中起重要作用(Kim-Joetal., 2019)。因寄生蜂毒液具有特殊的生理功能,可作为理想的资源用于发掘抗虫基因,用于新型杀虫制剂或转基因抗虫植物的研发(Beckage and Gelman, 2004; Danneelsetal., 2010)。而且,系统研究寄生蜂毒液蛋白功能,有助于深入揭示寄生蜂调控寄主的机制。虽然目前已就隶属茧蜂科(Brcaoindae)、姬蜂科(Ichneumonidae)、金小蜂科(Pteromalidae)等近10个科的20多种寄生蜂毒液组分进行鉴定,获得了丰富多样的上百种毒液蛋白,但是仅探明了钙网蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂和RhoGAP等少数毒液蛋白的功能(Poiriéetal., 2014; Moreau and Asgari, 2015; Yanetal., 2017; Liuetal., 2018; Yangetal., 2019; Duetal., 2020)。

为了抵御寄生蜂的寄生,寄主昆虫会利用高效的免疫系统进行防御反应。血淋巴黑化作为寄主昆虫重要的体液免疫反应,可伴随黑色素的形成,产生多种对寄生蜂后代有毒的物质(Clark, 2020)。酚氧化酶(phenoloxidase, PO)是昆虫体内参与黑化反应的关键酶,通常以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)形式存在于昆虫的血淋巴中(Luetal., 2014)。当外源物入侵昆虫时,会触发虫体内以酶原形式存在的丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)被激活,形成具有酶活性的酚氧化酶原激活蛋白酶(prophenoloxidase activating proteinase, PAP),进而切割PPO变为PO,迅速激活黑化反应(张明明等, 2012; Sugumaran and Barek, 2016; Veillardetal., 2016; Whitten and Coates, 2017)。SP酶活性的发挥是依靠其氨基酸序列内存在的由组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和丝氨酸(S)组成的催化三联体实现,如果其中某个催化三联体位点氨基酸残基发生缺失或突变,其催化功能受影响,将此类蛋白称为丝氨酸蛋白酶同源物(serine protease homologue, SPH)(Cao and Jiang, 2018)。在昆虫血淋巴黑化反应过程中,SPH对PO的级联反应起到重要的调控作用(Kanostetal., 2004; Felföldietal., 2011)。为了保证后代的成功发育,寄生蜂需攻克寄主的血淋巴黑化。有关寄生蜂毒液表观生理功能研究表明,它普遍具有抑制寄主血淋巴黑化的作用(Beckage and Gelman, 2004; 刘奎等, 2008; Becchimanzietal., 2017; Cusumanoetal., 2018)。

纵观有关寄生蜂毒液蛋白组分鉴定的研究结果可知,SP/SPH是寄生蜂毒液中普遍存在的蛋白组分,且通常作为高丰度蛋白存在(Poiriéetal., 2014; Zhu, 2016; Yeetal., 2020)。基于SP/SPH在昆虫血淋巴黑化反应中的重要作用,提示寄生蜂毒液SP/SPH应具有参与调控寄主昆虫血淋巴黑化的功能。然而,迄今有关寄生蜂毒液SP/SPH的功能研究甚少,仅探明了微红盘绒茧蜂Cotesiarubecula毒液Vn50(SPH)以及管氏肿腿蜂Sclerodermaguani毒液Vn7(SPH)具有抑制寄主血淋巴黑化的功能,更多寄生蜂毒液SPH的功能有待被揭示(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)。有鉴于此,本研究对另外一个管氏肿蜂毒液SPH基因SgSPH进行克隆表达,并分析其对寄主黄粉虫Tenebriomolitor蛹血淋巴酚氧化酶活性的影响。本研究结果将有助于理解和深入研究揭示管氏肿腿蜂毒液抑制寄主血淋巴黑化的内在机制。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

管氏肿腿蜂为实验室继代饲养种群,采用黄粉虫蛹为寄主进行繁育,不定期采集野外蜂种进行复壮(Zhuetal., 2013)。

1.2 基因克隆和序列分析

利用Trizol试剂(Invitrogen),参照试剂说明书,从约35头管氏肿腿蜂成虫中提取总RNA。总RNA经分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测,质量合格后,利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)将其反转录合成cDNA模板。根据实验室前期从管氏肿腿蜂毒液器官转录组中获得的SPH基因序列(Zhu, 2016),设计上游引物5′-ACGCCATATACAGTGCAACGT-3′和下游引物5′-TAGGAACCTCTGTTACCATATCT-3′,克隆毒液SgSPH基因的ORF序列。PCR反应体系(25 μL): cDNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, dNTP Mixture 12.5 μL, 超纯水9.5 μL。PCR反应条件: 94℃预变性30 s; 94℃变性30 s, 60℃退火40 s, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃10 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后,利用凝胶回收试剂盒进行回收纯化,克隆到pGEM®-T-easy载体(Promega),蓝白斑筛选,挑取阳性克隆送至上海杰李生物技术有限公司进行测序。用SignalP 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)对信号肽进行预测,氨基酸多序列比对采用Mafft v7.311软件的L-INS-i算法(Katoh and Standley, 2013)。

1.3 qPCR检测基因表达

分别收集管氏肿腿蜂不同发育阶段(卵、低龄幼虫、高龄幼虫、老熟幼虫、吐丝幼虫、黄茧蛹、黑茧蛹和羽化后1-5 d成虫)和解剖雌成虫不同组织(头部、胸部、去除毒液器官的腹部和毒液器官)样品于Trizol试剂中,研磨后保存于-80℃冰箱备用。参照试剂说明书,提取各样品总RNA,经DNAase处理去除其中的基因组DNA后,使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录获得cDNA模板。根据管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列设计引物(F: 5′-AATACGCCATATACAGTGCAA CGT-3′和R: 5′-GCAATCAGCAAGAGTCAAAAGAAA-3′),分别以18S RNA(F: 5′-TGGGCCGGTACGTTTA CTTT-3′和R: 5′-CACCTCTAACGTCGCAATAC-3′)和5.8S RNA(F: 5′-AAGAGCGACGCCAAACC-3′和R: 5′-ATG GGTCACTCGACTGGAT-3′)基因作为不同发育阶段和不同组织样品中基因表达量检测的内参基因,采用两步法扩增检测SgSPH基因的相对表达量,每个样品生物学重复3次,每个生物学重复至少来自5头管氏肿腿蜂。qPCR反应体系: SYBR® Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 8.5 μL。qPCR反应程序: 95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 58℃退火40 s, 45个循环。

1.4 基因原核表达及Western blot检测

在管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因ORF框两侧设计带有StuI和HindIII酶切位点的正向引物5′-AGGCCTACGCCATATACAGTGCAACGT-3′(下划线为StuI酶切位点)和反向引物5′-AAGCTTTA-GGAACCTCTGTTACCATATCT-3′(下划线为HindIII酶切位点),以1.2节中合成的cDNA为模板进行PCR扩增。纯化的PCR产物,采用StuI和HindIII进行双酶切,酶切产物经切胶纯化后在T4 DNA连接酶的作用下于4℃与带Sumo标签的质粒pSUMO-Mut载体(南京钟鼎生物技术有限公司)连接过夜,获得重组质粒。随后,将重组质粒传化至大肠杆菌EscherichiacoliTOP10感受态细胞,挑选阳性克隆进行测序验证。

将验证无误的重组质粒转化至Arctic Express宿主菌,挑取单克隆接种于含氨苄青霉素(50 μg/mL)的LB(Luria Broth)培养液中,于11℃ 220 r/min下培养,使用IPTG(0.5 mmol/L)进行诱导表达。将诱导表达后的培养菌液于低温6 000 g离心10 min后弃上清,用20 mL裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L PMSF, pH 8.0)重悬菌体沉淀,并对沉淀进行超声波破碎后,于4℃ 10 000 g离心20 min后弃上清。然后,用缓冲液(20 mmol/L Tris, 5 mmol/L DTT, 8 mol/L尿素,pH 8.0)溶解包涵体,4℃过夜后15 000 g离心15 min取沉淀,并用包涵体洗涤液(20 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 2 mol/L尿素, 1 mol/L NaCl, 1% Triton X-100, pH 8.0)洗涤3次,再进行超声破碎。最后,使用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化复性的基因表达产物,使用酶将其SUMO表达标签切除后,再次进行亲和纯化。基因表达情况和切除标签后的基因表达产物纯度使用12% SDS-PAGE电泳进行检测。

SDS-PAGE电泳后,将凝胶上的蛋白质转印到PVDF膜上,用清洗液(PBS-Tween Buffer)进行洗涤之后,用5%的脱脂奶粉溶液于室温下将PVDF膜封闭2 h,然后37℃条件下与SUMO抗体溶液孵育1 h,再用清洗液漂洗3次。接着放入经5%脱脂奶粉溶液稀释的羊抗鼠IgG二抗,37℃孵育1 h。最后,在洗液中漂洗3次后,用DAB显色后拍照,进行Western blot检测。

1.5 酚氧化酶活性测定

收集化蛹24 h的黄粉虫蛹血淋巴于无菌的1.5 mL离心管中,于4℃ 3 000 g离心10 min 去除血细胞,获得寄主血浆。迅速取6 μL寄主血浆于离心管中,接着往离心管中加入6 μL PBS,0.25和0.50 μg的纯化且切除表达标签的SgSPH重组蛋白,混匀后室温反应15 min。同时,分别以磷酸缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)和丙基硫尿嘧啶(propylthiouracil, PTU)作为阴性和阳性对照。每个处理生物学重复3次,每个生物学重复来自10头黄粉虫蛹血淋巴。反应结束后,从各离心管中分别取4 μL混合液加入96孔酶标板中,分别加入10 μL PBS和180 μL 0.01 mol/L的L-DOPA(Sigma)作为酶底物混匀,于15 min后490 nm处测定样品OD值。

1.6 数据分析

qPCR数据采用2-ΔΔCT法进行计算(Livak and Schmittgen, 2001)。 所有统计分析采用SPSS 17.0软件进行,采用Fisher’s least significant difference(LSD)法分析不同样本中管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的相对表达量以及不同处理间寄主黄粉虫蛹血淋巴酚氧化酶活性OD值的差异显著性。显著性水平均为P<0.05。 采用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software Inc.)制图。

2 结果

2.1 SgSPH基因克隆及序列特征

克隆获得的管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因(GenBank登录号: MT920663)的ORF长为798 bp,编码265个氨基酸,其中第1-20位氨基酸预测为信号肽。该基因编码氨基酸序列的理论分子量为30.53 kD,等电点为9.59。多序列比对分析发现,SgSPH与蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、微红盘绒茧蜂、黄痣黑瘤姬蜂Pimplahypochondriaca、阿尔蚜茧蜂Aphidiuservi以及丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis毒液SP/SPH的氨基酸序列一致性在9%~17%之间。而且,三联体酶催化活性中心(Asp, His和Ser)的氨基酸残基在SgSPH氨基酸序列中发生了突变,其中组氨酸(His)变为天冬氨酸(Asp),天冬氨酸(Asp)变为天冬酰胺(Asn),丝氨酸(Ser)突变为异亮氨酸(Ile),具有由6个保守的半胱氨酸残基组成的3对二硫键(图1)。

2.2 SgSPH基因表达特征

qPCR结果显示,管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因在卵、幼虫、蛹中低表达或几乎不表达,成虫羽化后开始表达,表达量逐渐增加,到羽化5 d时表达量最高(图2: A),该毒液基因在成虫阶段的表达量,与在其他发育阶段的表达量相比差异显著(P<0.05);在毒液器官中高表达,在头部、胸部和去除毒液器官的腹部中表达量较低(图2: B)。

图1 管氏肿腿蜂毒液SgSPH与其他寄生蜂毒液SP/SPH蛋白多序列比对

图2 管氏肿腿蜂不同发育阶段(A)和雌成虫不同组织中(B)毒液SgSPH基因的表达分析

2.3 SgSPH基因原核表达及纯化

利用表达载体pSUMO-Mut对管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,发现该基因低温条件下可被IPTG诱导表达,且主要在包涵体中表达(图3)。对包涵体中的表达蛋白进行复性处理、亲和纯化及SUMO标签酶切,SDS-PAGE电泳和Western blot检测发现,SUMO标签切除前后纯化的基因表达产物纯度均高。SUMO标签切除后的重组表达蛋白分子量约30 kD,这与预测的理论分子量吻合。这些结果表明,成功表达并纯化获得了管氏肿腿蜂SgSPH重组蛋白,且其纯度满足后续功能研究。

图3 管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的原核表达及蛋白纯化

2.4 SgSPH对寄主血淋巴酚氧化酶活性的影响

以L-DOPA为底物,测定分析复性后的管氏肿腿蜂SgSPH重组蛋白对寄主黄粉虫蛹血淋巴中的酚氧化酶活性的影响。结果如图4所示,经酚氧化酶抑制剂PTU处理的血淋巴酚氧化酶活性明显受到抑制。经PBS和0.25 μg SgSPH处理的血淋巴酚氧化酶活性间无显著差异(P>0.05),但经0.50 μg SgSPH处理的血淋巴酚氧化酶活性显著低于经PBS和0.25 μg SgSPH处理的(P<0.05),且与经PTU处理的血淋巴酚氧化酶活性间无显著差异(P>0.05),表明较高剂量下的管氏肿腿蜂毒液SgSPH能抑制寄主血淋巴黑化。

图4 管氏肿腿蜂SgSPH重组蛋白对寄主黄粉虫蛹血淋巴中酚氧化酶活性的影响

3 讨论

本研究基于前期管氏肿腿蜂毒液器官转录组中鉴定到的基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得了管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的ORF序列。序列分析表明,该基因编码的氨基酸序列中存在信号肽序列,说明它是可以分泌的毒液蛋白,具备典型毒液蛋白的分泌特征(Moreau and Asgari, 2015)。与其他昆虫SP/SPH具有二硫键结构一样,克隆得到的管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因编码的氨基酸序列内也存在形成二硫键的保守半胱氨酸残基(Veillardetal., 2016)。就保守的SP催化三联体残基而言,和已报道的微红盘绒茧蜂毒液Vn50和管氏肿腿蜂毒液Vn7(Asgarietal., 2003; Wuetal., 2020)相似,本研究克隆得到的毒液SgSPH基因编码蛋白氨基酸序列的催化三联体氨基酸位点发生了突变或缺失。序列分析结果不仅表明此处克隆获得的毒液基因确实为SPH成员,而且提示该毒液蛋白不具有蛋白水解酶活性。

有关寄生蜂毒液蛋白组分的鉴定结果表明,SP/SPH通常在寄生蜂毒液中大量存在(Poiriéetal., 2014)。如,SP/SPH是丽蝇蛹集金小蜂毒液中最具代表性的成分,并在蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum、中红侧沟茧蜂Microplitismediator、蝇蛹金小蜂Pachycrepoideusvindemmiae等毒液中大量存在(de Graafetal., 2010; Yanetal., 2017; Linetal., 2019; Yangetal., 2020)。此外,对管氏肿腿蜂毒液蛋白进行鉴定,也证实SP/SPH为该蜂毒液的高丰度组分(Zhu, 2016)。SP/SPH作为寄生蜂的高丰度毒液蛋白,它们会在毒液器官中高表达(Becchimanzietal., 2020)。qPCR分析结果表明,本研究克隆获得的管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因在毒液器官中高表达,在雌成虫其他组织中也有表达(图2: B)。目前,寄生蜂毒液SPH基因的表达调控机制尚不清楚,在毒液器官中高表达的调控机制值得后续深入研究。此外,基因表达特征结果显示,在不同发育阶段,管氏肿腿蜂毒液SgSPH基因的转录水平从黑茧蛹开始升高,到羽化后5 d的成虫中表达量最大(图2: A),其表达模式与寄生蜂毒液器官的发育相符合,同时也提示其可能参与虫体变黑和变态发育等过程(Liuetal., 2018; Wuetal., 2020)。

酚氧化酶是昆虫血淋巴黑化中的关键酶,其活性高低可以反映昆虫通过血淋巴黑化防御外来物入侵的强度(Whitten and Coates, 2017)。寄生蜂为了保证后代的成功发育,需要有效地抑制寄主昆虫血淋巴黑化反应产生的有害物质对其后代造成伤害(Beckage and Gelman, 2004; Kim-Joetal., 2019)。前期研究发现,管氏肿腿蜂寄生能抑制寄主黄粉虫蛹血淋巴黑化(Wuetal., 2020)。通过酶活性测定发现,0.50 μg剂量下的重组表达蛋白SgSPH能抑制寄主黄粉虫蛹血淋巴中的酚氧化酶活性(图4),表明SgSPH具有抑制寄主血淋巴黑化的功能。目前,已有数种具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白被鉴定,且它们是通过干扰酚氧化酶级联反应实现其生理功能(钱岑等, 2013; Wuetal., 2020)。如,布拉迪小环腹瘿蜂Leptopilinaboulardi毒液中的LbSPNy能明显地抑制寄主体内原酚氧化酶级联系统的激活(Colinetetal., 2009);微红绒茧蜂毒液中的Vn50通过与寄主酚氧化酶级联系统中的SPH竞争,从而抑制寄主血淋巴的黑化(Thomas and Asgari, 2011);蝶蛹金小蜂毒液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂PpS1V通过以寄主血淋巴中的PAP蛋白酶形成复合物来抑制原酚氧化酶的激活,进而抑制寄主血淋巴黑化(Yanetal., 2017)。据此认为,本研究报道的管氏肿腿蜂SgSPH可能与上述其他具有抑制寄主血淋巴黑化功能的寄生蜂毒液蛋白作用机制相似,是通过干扰寄主酚氧化酶级联反应发挥抑制寄主血淋巴黑化的功能,其内在机制有待进一步研究。

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