李 芳， 余梦瑶， 江 南， 贺黎铭， 姚 珂， 罗 霞

(四川省中医药科学院菌类药材研究所， 菌类药材系统研究与开发实验室， 中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室， 成都 610041)

1 引 言

灵芝是我国传统的补益中药，具有扶正固本的作用，现代药理研究表明灵芝具有抑制肿瘤[1]和免疫调节作用[2]，近年来常被用于肿瘤放化疗的辅助治疗.灵芝多糖和三萜是其主要药效成分，多糖对体外培养的肿瘤细胞无直接抑制作用，其抑瘤作用与免疫调节密切相关：促进树突细胞成熟和分化[3]，增强巨噬细胞的吞噬功能[4]，促进自然杀伤细胞活性[5]等；而灵芝三萜类成分主要通过直接毒杀肿瘤细胞而发挥抗肿瘤作用[6]，二者抗肿瘤作用没有直接的可比性，但适宜的配伍能有效提高抗肿瘤作用[7].

调节性T细胞(Treg细胞)是以CD4+CD25+FOXP3+为特征的T淋巴细胞亚群，是体内重要的免疫负调控细胞，是肿瘤免疫逃逸的关键因素[8].研究发现灵芝孢子多糖能有效抑制Treg细胞功能.但是灵芝子实体三萜、多糖配伍是否能有效提高对Treg细胞功能的抑制作用，目前尚无相关的研究报道.本研究利用前期研究获得的最佳抑瘤配伍剂量[7]，开展该方面的深入研究，有利于进一步阐释灵芝抗肿瘤的作用机制.

2 材料与方法

2.1 主要试剂

二甲亚砜(DMSO)、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ、胶原酶Ⅳ、牛血清白蛋白(BSA)，购自sigma公司.小鼠肿瘤浸润组织淋巴细胞分离液购自上海研谨生物科技有限公司.CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC、foxp3-PE流式抗体购自BD生物科技公司.Foxp3染色固定透膜液购自invitrogen公司.UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，购自生工生物工程股份有限公司.琼脂糖B、4S Red Plus 核酸染色剂、2X SG Fast qPCR Master Mix购自BBI公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、反转录试剂盒，购自Thermo Scientific公司.ELISA试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司；兔抗FOXP3多克隆抗体购自美国R&D公司.多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司.苏木素购自北京百灵威科技有限公司.中性树胶购自中国上海懿洋仪器有限公司.其余常用化学试剂购自成都科龙化工试剂厂.

2.2 方 法

2.2.1 实验动物造模和分组 Km(昆明种)小鼠，SPF级，雄性，体重18～22 g，由四川省中医药科学院动物中心提供，动物生产证号：SCXK(川)2013-19，饲养于SPF级动物房.灵芝多糖和三萜从赤芝子实体中提取获得.H22细胞株购自中科院细胞所，于小鼠腹腔内传代保存.每只小鼠右侧腋窝皮下准确接种H22细胞 2×106个，接种次日，小鼠随机分成对照组、三萜组、多糖组和配伍组，每组20只，分别以溶剂、灵芝三萜(90 mg/kg)、多糖(43 mg/kg)及多糖三萜(90 mg/kg+43 mg/kg)配伍腹腔注射给药，连续给药15 d，从第3 d起每2 d检测一次肿瘤直径，末次给药结束后颈椎脱臼处死小鼠，分离腋下肿瘤称重，计算抑瘤率和体积(0.52×长×宽2)，绘制肿瘤生长曲线.

2.2.2 灵芝多糖和三萜的提取 按照《中国药典2015版》中灵芝多糖和三萜提取和含量测定方法操作[9]，采用Sevag法除去提取物中的蛋白质后对灵芝多糖和三萜含量进行测定。

2.2.3 流式细胞术检测Treg细胞数量 解剖小鼠肿瘤组织，用RPMI1640培养基洗去血污.称取1 g左右的肿瘤组织，加入4 mL酶解液，用眼科剪剪碎至2～5 mm3大小，置37 ℃酶解2 h.取酶解液，以200目不锈钢网过滤，除去未酶解完全的组织块.取玻璃试管，加入5 mL小鼠肿瘤浸润淋巴细胞分离液，离心后获得淋巴细胞.洗涤淋巴细胞两次后加入CD3、CD4、CD25抗体室温避光孵育30 min后离心5 min，弃上清.加入1 mL染色缓冲液，重悬细胞，400～600 g离心5 min，弃上清.完成表面抗原染色后的细胞，再加入1 mL Foxp3染色固定透膜液，室温孵育1 h.加入透膜缓冲液重悬细胞，离心后弃上清，加入FOXP3抗体染色后上流式细胞仪检测.

2.2.4 荧光定量PCR检测mRNA水平 按15～25 mg小鼠肿瘤组织加入0.5 mL Trizol用匀浆器匀浆处理，获得的匀浆液按柱式 Trizol 总RNA抽提试剂盒操作步骤进行总RNA提取，按照反转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA.PCR反应体系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、正反引物各0.4 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 7.2 μL.PCR循环条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45个循环.为保证结果的精确性，重复三次每个反应.

引物序列:

GAPDH-F：5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，

GAPDH-R：5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′；

CCL22-F：5′-TCTCGTCCTTCTTGCTGTGG-3′，

CCL22-R：5′-GCAGAGGGTGACGGATGTAGT-3′；

CCR4-F：5′-CATCTCGGATTTGCTGTTCG-3′，

CCR4-R：5′-CTGGTGATGACGCCATAGGT-3′；

FOXP3-F：5′-TGGTTTACTCGCATGTTCGC-3′，

FOXP3-R:5′-AACTCAAATTCATCTACGGTCCA-3′.

2.2.5 ELISA法检测细胞因子含量 将小鼠肿瘤组织研磨成细胞悬液，离心后取上清，然后按试剂盒说明书进行具体操作.用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度.

2.2.6 免疫组化染色法检测肿瘤组织中FOXP3蛋白的表达 处死小鼠，解剖下肿瘤组织，放入4%多聚甲醛溶液中，固定48 h，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，制备组织切片.脱蜡后的切片放入染色缸，3%甲醇双氧水室温10 min；PBS洗3次，每次5 min；将切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)，微波炉中高火加热至沸腾后断电，间隔5 min后，反复1次，冷却后，PBS洗2次，每次5 min；滴加山羊血清封闭液，室温20 min；滴加一抗，4 ℃过夜；滴加生物素化二抗，37 ℃30 min；PBS水洗3次，每次5 min；DAB显色：使用DAB显色试剂盒，混匀试剂后滴加到切片上，室温显色，镜下控制反映时间2 min，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片.采用显微成像系统拍照后，以Image pro plus6.0软件对阳性表达区域进行累积光密度(IOD)分析.

3 结果与分析

3.1 灵芝多糖和三萜的含量测定

3.1.1 灵芝多糖含量 按中国药典中硫酸蒽酮法检测，灵芝多糖标准曲线测定结果如下：

图1 多糖标准曲线Fig.1 Polysaccharide standard curve

根据样品吸光度由公式y=8.6905x+0.2176计算出提取物样品中多糖含量为481.90 mg/g.

3.1.2 灵芝三萜含量 按中国药典中方法检测，灵芝三萜标准曲线测定结果如下：

根据样品吸光度由公式y=12.634x+0.0106计算出提取物中三萜含量为434.40 mg/g.

图2 三萜标准曲线Fig.2 Triterpene standard curve

3.2 H22荷瘤小鼠瘤体生长情况

小鼠处死后立即解剖下肿瘤组织，称重，各组小鼠瘤重及肿瘤体积分别见表1和图3.与对照组相比，各给药组解剖下的小鼠瘤重都明显更轻，其中灵芝多糖组具有显著性差异(P<0.05)，配伍组具有极显著性差异(P<0.01)；配伍组抑瘤率明显高于多糖组和三萜组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01).各给药组肿瘤体积均较对照组减小(P<0.05，P<0.01)，配伍组肿瘤体积明显小于多糖组和三萜组，差异具有统计学意义(图 1，P<0.05，P<0.01).表明灵芝多糖和三萜均能抑制小鼠H22瘤体生长，二者配伍给药能增强抑瘤作用.

表1 小鼠瘤体重量及抑瘤率

图3 肿瘤生长曲线图

3.3 灵芝对小鼠肿瘤微环境中Treg细胞数量的影响

经流式细胞法测定小鼠肿瘤组织中Treg细胞(CD4+CD25+foxp3+)在CD4+细胞中的比例，统计结果如表 2所示，流式结果图见图4.与对照组相比，各给药组小鼠肿瘤微环境中Treg细胞比例均有所降低，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；配伍组Treg细胞比例明显低于三萜组和多糖组，差异具有统计学意义(P<0.05).结果表明，灵芝多糖和三萜均能降低肿瘤微环境中Treg细胞比例，二者配伍给药具有协同效应.

表2 小鼠肿瘤微环境中Treg细胞比例

3.4 Treg细胞趋化相关关键基因的RT-PCR检测

经检测小鼠肿瘤微环境中Treg 细胞趋化相关关键基因：趋化因子CCL22及其受体CCR4和FOXP3在肿瘤组织中的表达，结果如图5所示.与对照组相比，灵芝三萜组和多糖组中相关基因的表达无明显变化，配伍组相关基因的表达明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)，配伍组的CCL22、CCR4和FOXP3基因表达水平都明显低于三萜组和多糖组，差异具有统计学意义(P<0.01).结果表明，灵芝三萜、多糖配伍给药能降低Treg 细胞趋化相关关键基因的表达，减少Treg细胞向肿瘤微环境中趋化.

图4 小鼠肿瘤微环境中Treg细胞比例流式图Fig.4 FACS analyses of Treg cell ratio in mouse tumor microenvironment

图5 肿瘤微环境中基因表达分析图

3.5 肿瘤微环境中细胞因子水平

经检测肿瘤组织中细胞因子IL-10、TGF-β1和IL-2含量，统计结果如图6所示.与对照组相比，各给药组的IL-10和TGF-β1的含量均有所降低，其中多糖组和配伍组差异具有统计学意义(P<0.05)；配伍组IL-10和TGF-β1水平明显低于三萜组和多糖组，差异具有统计学意义(P<0.05).与对照组相比，各给药组的IL-2的含量均有所降低，多糖组和配伍组差异具有统计学意义，配伍组IL-2水平明显高于三萜组和多糖组(P<0.05).结果表明，灵芝三萜和多糖均能降低IL-10和TGF-β1水平，同时增加IL-2水平.

图6 小鼠肿瘤组织中细胞因子含量

3.6 肿瘤微环境中FOXP3蛋白表达水平

各组肿瘤组织中FOXP3阴性细胞呈蓝色，底物呈白色，阳性细胞呈黄色或棕黄色，FOXP3阳性产物主要分布在细胞核、细胞质及细胞间质.与对照组相比，各给药组FOXP3均呈现较弱的表达水平(图7).

图7 小鼠肿瘤微环境中FOXP3蛋白表达Fig.7 Expression of FOXP3 protein in mouse tumor microenvironment

平均光密度统计结果(表 3)显示，与对照组相比，各给药组小鼠肿瘤组织FOXP3蛋白含量均有降低，其中三萜组和配伍组差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；配伍组小鼠肿瘤组织FOXP3蛋白含量明显低于三萜组和多糖组，其中多糖组与配伍组差异具有统计学意义(P<0.05).结果表明，灵芝三萜和多糖均能降低小鼠肿瘤组织中FOXP3蛋白的表达，二者配伍给药具有协同效果.

表3 小鼠肿瘤组织FoxP3平均光密度统计结果

灵芝多糖类制剂近年来常被用于临床肿瘤患者放化疗的辅助治疗，在提高患者对放化疗的耐受性、增强免疫、减轻副反应等方面的效果都已被临床初步证实[10-11]，而灵芝三萜类成分目前尚无临床应用报道.灵芝多糖、三萜配伍使用能显著提高抑瘤效果，目前已在动物实验得到证实[12]，在获得灵芝多糖、三萜抗肿瘤最佳配伍剂量的基础上，开展二者配伍使用的内在机制研究，可为灵芝辅助治疗肿瘤提供理论依据与指导.

肿瘤微环境(TME)是支持肿瘤产生、生长和转移的复杂肿瘤生态系统，包含肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、细胞间质、微血管以及浸润其中的生物分子[13].近年在TME中发现了新的靶点，可以帮助指导和改善各种癌症治疗的作用，特别是通过增强宿主抗肿瘤免疫反应而起作用的免疫疗法[14]，是近年免疫治疗研究热点.Treg细胞是肿瘤微环境中一类免疫负调控细胞，主要是CD4+CD25+FOXP3+细胞，原本在胸腺、骨髓、淋巴结以及外周血中自然产生，经趋化因子CCL22与其受体CCR4的结合，将其趋化至肿瘤微环境中[15].Treg细胞能够直接接触抑制靶细胞活性，通过分泌IL-10及TGF-β等细胞因子抑制Th细胞的增殖分化及其分泌细胞因子，抑制效应细胞的免疫应答，是肿瘤免疫逃逸的关键因素[16].

Sun等[17]的体外实验研究发现，灵芝孢子多糖可使B16F10黑素瘤细胞培养液中的IL-10及TGF-β生成显著减少，有效抑制Treg细胞活性.Li等[18]研究表明，灵芝多糖能显著抑制肝癌小鼠肿瘤生长，抑制肿瘤微环境中FOXP3的表达，减少Treg细胞向肿瘤组织中募集，消除Treg 细胞的免疫抑制，使肿瘤微环境中免疫平衡偏向效应性T细胞.本研究发现灵芝子实体多糖同样能减少IL-10、TGF-β生成及FOXP3的表达，Treg细胞向肿瘤组织中募集，三萜本身无此作用，但通过三萜、多糖配伍使用后作用效果增强，因此，三萜能协同增强多糖对肿瘤微环境中Treg细胞功能抑制效应.

灵芝三萜能快速增强机体抗肿瘤免疫活性，促进肺癌小鼠机体产生白介素-2(IL-2)，并提高自然杀伤(NK)细胞的免疫活性[19].Treg细胞主要表面抗原CD25，是白介素2受体α链(IL-2Rα)，能竞争性与IL-2结合，使肿瘤微环境中效应T细胞因为缺乏IL-2受到抑制[20].本研究发现灵芝三萜及配伍均提高了肿瘤微环境中IL-2水平，三萜可能通过增加IL-2的分泌或解除Treg细胞引起的IL-2竞争，对多糖抑制Treg细胞功效起到协同作用.

综上所述，本研究从肿瘤微环境中Treg细胞数量、特异蛋白表达、趋化因子mRNA水平及细胞因子水平等方面分别考察灵芝多糖、三萜对Treg细胞功能的影响研究，确认了灵芝三萜、多糖对肿瘤微环境中Treg细胞功能的抑制作用，有利于促进机体抗肿瘤免疫.