马秋月，李倩中，李淑顺，朱 璐，颜坤元，李淑娴，张 斌，闻 婧*

(1.江苏省农业科学院休闲农业研究所，江苏 南京 210014；2.南京林业大学，南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037)

元宝枫(AcertruncatumBunge)为槭属(Acer)落叶小乔木，树高8～13 m，主要分布于我国的黄河流域，以及东北、内蒙古、江苏、安徽等地区[1]，为我国园林绿化的主要树种之一。元宝枫还是一种多用途的木本油料树种，种仁中含油脂约48%、蛋白质25%～27%，种皮含单宁可达60%，叶中还含有黄酮、绿原酸、强心苷等多种活性物质[2-3]；其油脂的脂肪酸组成中含有5%～6%的神经酸，神经酸是世界公认的能修复、疏通受损大脑神经纤维并促使神经细胞再生的有效物质，帮助治疗脑中风后遗症、脑萎缩、老年痴呆症等世界性疾病的潜力巨大[4-7]。元宝枫油于2011年被中华人民共和国卫生部批准为新资源食品，2017年被国家林业和草原局确定为珍贵木本油料树种，江苏省将其列入珍贵彩色树种名录。因此，开展集观赏及药食同源于一体的元宝枫优良种质的规模化育苗技术研究意义重大。目前，元宝枫常规生产主要以播种或嫁接方式繁殖为主，关于元宝枫繁育技术的研究相对较少。于震宇[8]曾进行了元宝枫的愈伤组织诱导培养；李艳菊等[9]于2005年在元宝枫的组培快繁方面取得了一定进展，但有关组培成苗的报道鲜见。以往常规的播种或嫁接繁殖过程发现，种苗质量受繁殖材料的影响会出现品质退化或病虫害积累等问题，种苗繁殖受季节影响很大，优良遗传性状难以保持稳定，导致良种推广种植受到极大限制。实践表明，对于重要树种，利用组培快繁技术能在短期内快速成苗[10]。为此，以元宝枫1年生茎段为试验材料，通过对外植体采集时间、外植体的消毒时间、腋芽诱导和生根培养基的配方筛选及优化，建立元宝枫离体培养成苗快速繁殖体系，以期为元宝枫优良种质的栽培规模化及产业化提供科学依据及技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料来源及外植体处理

选择不同时期(5、7和9月)健壮、无病虫害的元宝枫优良植株(大田和温室盆栽)，以当年生枝条为供试材料，植株来自南京市溧水区江苏省槭树良种基地和江苏省农业科学院温室盆栽，外植体为带芽茎段。

处理方法：将外植体切割成2～3 cm的带芽茎段，用0.05%的洗衣粉溶液清洗表面2 min，再用无菌水清洗至洗衣粉溶液洗脱干净。在超净工作台上，按照体积分数75%乙醇(处理时间10、20、30 s)和质量分数0.1%的HgCl2(处理时间120、180、240 s)不同组合的混合处理进行充分振荡灭菌，每个组合经处理后均用无菌水清洗5次，并置于无菌纸上，吸干表面水分，将完成灭菌的外植体接种于腋芽诱导培养基中。所有的培养基pH均为5.8，培养温度为(25±2) ℃，光照度为2 000 lx，每天光照12 h。

1.2 元宝枫茎段腋芽诱导的培养

选取经过灭菌处理后长势一致的茎段接种到腋芽诱导培养基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69(购自北京酷来搏科技有限公司)为基本培养基，分别添加不同质量浓度的IBA(0、0.2和0.4 mg/L)和30 g/L蔗糖的固体培养基中，共12个处理组合，每个处理接种30个外植体，重复3次，10 d后观察并统计外植体的出芽率和污染率。其中：污染率=(污染的外植体数/接种的外植体总数)×100%，死亡率=(死亡的外植体数/接种的外植体总数)×100%，成活率=(移栽成活的株数/移栽的总株数)×100%，出芽率=(出芽的外植体数/接种的外植体总数)×100%。

1.3 有效苗培育和生根培养

当腋芽诱导后获得的无菌芽苗约0.5 cm时，将其切下转入生根诱导培养基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69为基本培养基，在每种基本培养基中分别添加不同质量浓度的IBA(0.2、0.4和0.6 mg/L)和15 g/L的蔗糖，每个处理接种30个外植体，重复3次，共12个处理组合。于25 d后观察记录结果，并统计生根率、根数及根系生长状况(分为长势最好、长势一般、长势稍差)。

1.4 炼苗及移栽

打开已生根且生长健壮的元宝枫苗组培瓶封口膜，在培养室中进行环境适应性锻炼7 d后，将组培苗从培养瓶中取出，用清水将培养基冲洗干净，移栽至苗钵中，其中基质泥炭土、珍珠岩、蛭石体积比为7∶2∶1，且基质在移栽1周前用20%的多菌灵溶液消毒，移栽后进行常规管理。

1.5 数据处理

试验所有数据在Excel 2020中整理，以平均值±标准误表示，采用SPSS 22.0软件进行One-way ANOVA分析，利用LSD进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同处理方法对外植体灭菌效果的影响

不同处理和不同消毒时间对元宝枫外植体的污染和死亡造成了明显的影响(表1)。其中处理1的污染率显著高于其他处理(P<0.01)，成活率只有4.1%；随着处理时间的延长，污染率逐渐降低，成活率有所提高。从污染率来看，本研究中经过75%乙醇灭菌30 s+0.1%HgCl2灭菌240 s(处理9)的效果最佳，成活率为61.9%。同时可以看出，随着HgCl2灭菌时间的增加，元宝枫外植体的成活率反而降低，说明过长时间的HgCl2处理会对植物组织产生一定的毒害作用，从而影响其正常生长，甚至会导致死亡。因此综合考虑外植体的污染率和成活率，外植体的最适消毒时间为：75%乙醇灭菌30 s+0.1%HgCl2灭菌180 s。

表1 不同处理对外植体灭菌效果的影响Table 1 Effects of different disinfection methods on explants

为进一步研究不同时期及不同立地环境采集外植体对灭菌效果的影响，在不同季节(5、7和9月)以及不同立地环境(大田植株和温室盆栽苗)采集外植体，经过75%乙醇灭菌30 s及0.1%HgCl2灭菌180 s后比较不同处理间的污染率情况，结果(表2)显示：5月采集的外植体污染率最低，且大田植株和温室盆栽苗外植体污染率差异不大；7月的大田污染率要略高于温室盆栽外植体；9月大田植株的外植体与室内盆栽污染率差异极其显著，室外大田污染率高达94.4%，而室内盆栽为31.1%，说明7月份以后更适合在室内采集元宝枫外植体。

表2 不同时期采集外植体对污染率的影响Table 2 Effects of pollution rate of explants collected in different periods

2.2 基本培养基和外源激素对腋芽诱导的影响

以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69为基本培养基，添加不同浓度的IBA对元宝枫腋芽或顶芽的诱导有显著影响(表3、图1)。

表3 不同培养基和外源激素对腋芽诱导的影响Table 3 Effects of different culture mediums and exogenous hormones on cluster bud

A.元宝枫茎段stem segment of A.truncatum；B.腋芽的诱导induce axillary buds；C1-C2.生根的组培苗rooting of tissue culture seedling；D.移栽成活的组培苗tissue culture seedlings were transplanted。图1 元宝枫腋芽的诱导与生根Fig.1 Axillary buds and root induction of Acer truncatum

由表3可见，添加0.2 mg/L IBA和0.4 mg/L IBA处理的芽诱导率较高，均在85%以上，且不定芽生长良好，15 d后就可看到翠绿叶片(图1B)，但是不同的基本培养基诱导腋芽出芽及展叶时间差别较大，其中处理8培养基的效果最佳。大部分处理组合培养结果显示，当IBA质量浓度为0.2 mg/L时，其诱导率高于未添加激素和0.4 mg/L的处理；诱导率呈现先上升后下降的趋势，说明添加过高浓度的IBA对元宝枫诱导芽起到抑制作用。比较12个处理可知，诱导元宝枫外植体产生腋芽的最佳培养基为：NN69+IBA(0.2 mg/L)。

2.3 不同基本培养基和外源激素IBA对元宝枫诱导生根的影响

将1～2 cm生长健壮的腋芽转入生根诱导培养基中培养7 d左右，在茎段基部接触培养基处有根基凸起，形成根原基；15 d左右出现不定根，培养30 d后形成完整根系(图1C1、1C2)。尽管每种处理的培养基均能不同程度地诱导元宝枫生根(表4)，但是当IBA的质量浓度为0.2～0.4 mg/L时，生根率随着浓度的增加而增加，而质量浓度在0.4～0.6 mg/L时，生根率反而下降。通过不同基本培养基和不同浓度激素处理下对元宝枫组培苗生根效果进行显著性分析表明：以1/2 NN69为基本培养基、IBA质量浓度为0.4 mg/L时生根率最高，可达87.8%，且根系生长发达，平均根数也最多。因此基于生根率、生根数以及根系生长状况综合分析认为，1/2 NN69+ IBA(0.4 mg/L)是诱导元宝枫生根的最适宜配方组合。

表4 不同培养基和外源激素对生根的影响Table 4 The effects of different culture mediums and hormones on rooting

2.4 元宝枫组培苗的炼苗与移栽

将经过7 d炼苗后生长健壮的组培苗从培养瓶中取出，用无菌水清洗根部培养基后移入泥炭、珍珠岩、蛭石体积比为7∶2∶1的基质(经过20%的多菌灵溶液消毒)中进行移栽，保持中等湿度，苗长成活率达95.0%以上。

3 讨 论

3.1 元宝枫外植体取材时间及方式

外植体的表面灭菌是组织培养中至关重要的一步[11]，且不同植物不同部位的外植体对消毒剂的敏感程度也不同。关于元宝枫的组织培养技术，李艳菊等[9]以不同树龄和不同季节的元宝枫大田苗外植体为材料进行组培，发现外植体对组培苗的污染率和存活率会产生很大影响。本研究除采集室外大田材料，同时以温室盆栽材料为对照，比较不同的外植体灭菌处理方式对不同时期、不同采集地点元宝枫组织培养过程污染率及成活率的影响，研究发现HgCl2灭菌的时间过长或过短都会影响元宝枫的成活率，这与高盆樱桃(Cerasuscerasoides)[12]、牛樟(Cinnamomumkanehirae)[13]、狭叶黄芩(Scutellariaregeliana)[14]等材料组培效果相近。但本研究中发现9月左右在室外大田采集外植体，元宝枫组培污染率极高，这可能与室外高温潮湿、杂菌和灰尘较多，容易通过皮孔或伤口进入植物体内部，造成内生菌寄生有关[13,15-16]，但该时期室内采集的效果较好，污染率较低。

3.2 基本培养基及外源生长调节剂IBA对元宝枫组织培养的影响

不同植物由于遗传背景及生物学特性有一定的差异，因此对基本培养基各类营养成分的需求也有很大差别，同时外源生长调节剂的合理配比对不定芽的诱导以及增殖、生根等尤为重要[17]。已有研究发现槭树科内不同的种之间差异较大，如：李艳敏等[18]发现WPM基本培养基与IBA组合，更适宜金叶复叶槭(Acernegundo‘Aurea’)的增殖与生根生长；李岩岩[19]发现在1/2 MS基本培养基中添加1.0 mg/L的IBA对茶条槭(Acerginnalum)的生根有很好的效果；顾地周等[20]在MS培养基中添加KT和IBA外源激素对诱导生根效果明显；而李艳菊等[9]的研究结果显示，在MS培养基中添加适宜浓度的TDZ和IBA可有效促进元宝枫外植体的增殖和生长。

IBA是组培苗不定芽和根的诱导中常用的生长调节剂[21-22]，本研究以1/2 MS、1/2 NN69、MS和NN69为基本培养基，附加不同浓度的IBA对元宝枫进行腋芽和生根诱导培养，结果发现4种培养基配合不同浓度IBA均可诱导腋芽生长，但诱导时间差异较大，其中以NN69中添加0.2 mg/L IBA诱导率最高，时间最短。同样，组培苗的生根能力强弱及根系的生长状况也直接影响植株的移栽成活率[14]。本研究表明，在1/2 NN69的基本培养基中添加0.4 mg/L的IBA时外植体生根效果最好，生根率可达87.8%，且根系健壮，移栽成活率可达95.0%；但IBA浓度过高或过低均未较好地促进根的诱导，类似现象在其他植物组织培养中也常见[12-14,23-24]。

目前，元宝枫的种苗繁育主要以播种、扦插或嫁接技术繁殖为主，但存在受季节影响或优良特性难以稳定保存的问题。本研究以元宝枫茎段为外植体，筛选适宜元宝枫不定芽及生根的最优培养基，建立了一套从元宝枫无菌外植体、腋芽诱导和生根诱导及炼苗移栽的元宝枫组培快繁体系，为短时间内繁育大量元宝枫优良株系以及推广应用提供了重要技术支撑和理论保障，也可为后期元宝枫再生遗传转化体系的建立提供技术参考。