石欣隆，杨月琴，薛 娴，刘 伟，宋程威，郭丽丽，侯小改*

(1.河南科技大学农学院/牡丹学院，河南 洛阳 471023；2.河南省油用牡丹工程技术研究中心，河南 洛阳 471023)

牡丹(Paeoniasuffruticsa)是我国特有的木本名贵花卉，集观赏、药用、食用等多种价值于一身[1]。干旱会直接影响牡丹体内的生理生化过程，造成形态结构发生变化，根系活力下降，最终导致生长受抑制，严重时会直接导致植株死亡，造成农业经济损失[2-3]。因此，开展牡丹抗旱相关性研究具有重要意义。‘凤丹’(P.ostii‘Feng Dan’)在油用牡丹品种中结实能力较强，出油率高，是提供牡丹籽油原料的重要品种[4-5]。‘凤丹’籽油中油酸、亚油酸、亚麻酸等对人体有益的不饱和脂肪酸含量丰富，其中作为人体必需的亚麻酸质量分数高达42.82%，油用表现相当可观[5-6]。故本研究选用‘凤丹’作为研究材料。

壳寡糖(chitooligosaccharide，COS)是一种新兴抗逆诱导剂，可使植物维持较高的叶绿素含量，降低叶片气孔开度，提高光合性能，促进作物生长，还能调节LEA基因表达，促进植物体内蛋白质和核酸的合成，进而延缓衰老，提高植物抗逆性[7-9]。干旱胁迫下外施COS可提高玉米(ZeamaysL.)叶片的相对含水量和叶绿素含量，且超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性增加，从而提高玉米的抗旱能力[10-11]。在甘蔗(SaccharumL.)中同样发现外源COS能提高其抗氧化酶活性，并能增加叶片中的渗透物质含量，改变细胞质膜渗透率，减缓膜质过氧化，从而缓解干旱胁迫对其的毒害作用[12-13]。目前有关COS促进牡丹抵御干旱胁迫的研究鲜见报道。笔者以两年生油用牡丹品种‘凤丹’(P.ostii‘Feng Dan’)盆栽苗为试验材料，探究叶面喷施COS对干旱胁迫下‘凤丹’植株生长生理及抗氧化酶系统的影响，为农业生产中施用外源物质提高牡丹抗旱性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在河南科技大学牡丹试验基地进行。供试材料为生长健康、长势一致的两年生盆栽‘凤丹’苗，花盆直径18 cm，高17 cm，盆栽基质为河沙与田园土按体积比5∶1混匀。试验前期统一浇水量，正常水分管理。供试试剂为购自上海圻明生物科技有限公司，相对分子量<3 000的COS溶液。

1.2 试验设计

采用逐渐干旱对‘凤丹’盆栽苗进行干旱胁迫。2018年5月25日停止浇水，开始进行干旱处理，7 d后(即2018年5月30日)分别用20、40、60、80 mg/L COS溶液整株喷施，以清水为对照(CK)，共喷施3次，即测定日6：00、12：00、18：00各喷施1次，每株每次喷施量为20 mL。各处理重复3次，每个处理30株。分别于断水后7、9、11、13、15 d选取从下向上倒数3叶，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 指标测定

1.3.1 形态指标及生物量

断水后第15天，各处理随机选取5株‘凤丹’，整株从盆中取出，蒸馏水清洗干净后用直尺测量苗高，游标卡尺测量茎粗。随后，分别称量地上部生物量和地下部生物量，并计算幼苗总生物量和根冠比。

1.3.2 叶片相对含水量

断水7 d起，每隔2 d用饱和含水量法[14]测定叶片相对含水量(relative water content，RWC，公式中记为CRWC)。计算公式为：CRWC=[(WF-WD)/(WT-WD)]×100%。式中，WF为叶片鲜质量，WT为叶片浸水24 h后达到叶片吸水饱和稳定时的叶片质量，WD为80 ℃烘干48 h后的叶片质量。

1.3.3 叶绿素含量和净光合速率

采用丙酮法[15]测定‘凤丹’叶片叶绿素含量(chlorophyll content，Chl)；用Li-6400便携式光合仪(LI-COR，Lincoln，Nebraska，USA)测叶片净光合速率(Pn)，选择晴朗天气，测定时间为9：00—11：00。

1.3.4 叶片丙二醛和过氧化氢含量

采用苏州科铭生物技术有限公司生产的丙二醛含量试剂盒、过氧化氢含量试剂盒分别测定叶片中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)和过氧化氢(H2O2)含量。

1.3.5 叶片抗氧化酶活性

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用氮蓝四唑比法测定，过氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈创木酚氧化法测定，过氧化氢酶(catalase，CAT)活性采用紫外吸收法测定[15-16]。

1.3.6 叶片渗透调节物质含量

可溶性糖(soluble sugar，SS)含量采用蒽酮乙酸乙酯法测定，可溶性蛋白(soluble protein，SP)含量采用考马斯亮蓝法测定，脯氨酸(proline，Pro)含量采用磺基水杨酸法测定[15-16]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和IBM SPSS 19.0软件进行数据处理和分析，测定结果用平均值±标准差表示，并运用Duncan’s法进行差异显著性检验(α=0.05)，采用Origin 9.0软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 COS对干旱胁迫下‘凤丹’幼苗生长的影响

由不同COS处理对干旱胁迫下‘凤丹’幼苗生长的影响情况(表1)可知，随着COS浓度的升高，停水15 d的‘凤丹’幼苗苗高、茎粗、地上生物量、地下生物量和总生物量均呈现先升高后下降的趋势，而根冠比呈降低趋势，说明干旱胁迫显著抑制了‘凤丹’幼苗的生长；而喷施COS可以有效缓解干旱胁迫对‘凤丹’幼苗生长造成的损伤，且主要促进‘凤丹’地上部分的生长发育。与CK处理相比，喷施40 mg/L COS处理下干旱15 d的‘凤丹’幼苗苗高、茎粗、地上生物量、地下生物量和总生物量分别增加了25.46%、17.79%、45.97%、20.69%和34.30%，说明喷施40 mg/L的COS对提高‘凤丹’抗旱性效果最佳。

表1 COS对干旱胁迫下‘凤丹’幼苗生长的影响Table 1 Effects of COS on the growth of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.2 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片相对含水量的影响

不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters in the same column meant significant difference at 0.05 level among treatments.The same below.图1 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片相对含水量的影响Fig.1 Effects of COS on RWC of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

由 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片相对含水量的影响情况(图1)可知，随着干旱胁迫时间的延长，‘凤丹’叶片RWC呈下降趋势，相同干旱时间内各处理叶片RWC均高于CK组。断水第7天，各处理间叶片RWC差异不显著(P>0.05)；断水第9天，喷施20 mg/L COS后‘凤丹’叶片RWC略高于CK，其他处理组间叶片RWC差异不显著，但均显著高于CK(P<0.05)；断水第11天后，同等干旱程度下‘凤丹’叶片RWC随着COS喷施浓度的增加呈先升高后降低趋势，且喷施40 mg/L COS后‘凤丹’叶片RWC均显著高于其他处理组，与CK相比，‘凤丹’叶片RWC随干旱程度的加剧分别增加了11.09%、17.66%、11.76%。

2.3 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片叶绿素含量和净光合速率的影响

由COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片叶绿素含量和净光合速率的影响情况(图2)可知，相同浓度COS处理下，‘凤丹’叶片Chl含量和Pn随着干旱天数的增加均呈先上升后下降趋势。与CK相比，相同干旱时间内各处理间‘凤丹’叶片Chl含量和Pn均有所增加，说明喷施外源COS能够提高干旱下‘凤丹’叶片的叶绿素含量和净光合速率。干旱7 d时，喷施60 mg/L COS后‘凤丹’叶片Chl含量显著高于其他各处理；干旱9 d 后，随着干旱时间的延长，喷施40 mg/L COS可显著提高‘凤丹’叶片Chl含量(图2A)。喷施COS后干旱胁迫下‘凤丹’叶片Pn变化趋势与叶片Chl含量一致(图2B)。与CK相比，喷施40 mg/L COS效果最佳，可使‘凤丹’叶片Pn显著提高16.40%、18.20%、43.10%、45.56%、93.52%。

图2 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片叶绿素含量、净光合速率、MDA与H2O2含量的影响Fig.2 Effects of COS on chlorophyll content,Pn,MDA and H2O2 contents of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.4 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片丙二醛含量和过氧化氢含量的影响

喷施相同浓度COS后，各处理‘凤丹’叶片中MDA和H2O2含量随着干旱时间的延长呈升高趋势(图2C、2D)。由图2C可知，与CK相比，各干旱时间内喷施20 mg/L COS后‘凤丹’叶片中MDA含量降低不显著，喷施高质量浓度COS(40～80 mg/L)后均显著降低(P<0.05)，其中40 mg/L COS效果最佳，各干旱时间的‘凤丹’叶片中MDA含量分别降低了23.27%、12.23%、23.22%、17.27%、20.63%。喷施COS可显著降低‘凤丹’叶片中H2O2含量(图2D)，且喷施高质量浓度COS (40～80 mg/L)后‘凤丹’叶片H2O2含量差异不显著(P>0.05)，但均显著低于CK(P<0.05)。与CK相比，喷施40 mg/L COS后各干旱时间的‘凤丹’叶片中H2O2含量分别降低了16.65%、22.82%、30.75%、29.14%、38.62%。

2.5 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片抗氧化酶活性的影响

随着干旱程度的增加，‘凤丹’叶片SOD、POD、CAT活性均表现为先升高后降低趋势，喷施不同质量浓度COS后，相同干旱程度下‘凤丹’叶片的SOD、POD、CAT活性随COS质量浓度的增加呈逐渐升高趋势，说明外源COS能够提高干旱胁迫下‘凤丹’叶片的抗氧化酶活性(图3)。由图3A可知，干旱7 d，各处理间叶片SOD活性较低，随着干旱程度的增加，SOD活性逐渐增加；高质量浓度COS(40～80 mg/L)的喷施可显著提高叶片SOD活性(P<0.05)；从各干旱处理段综合看，当COS质量浓度超过40 mg/L即可达到显著提高效果。随干旱程度的增加，喷施外源COS后‘凤丹’叶片POD活性的变化趋势与SOD一致，具体表现为高质量浓度COS可显著促进POD活性的提高(图3B)。由图3C可知，喷施COS可提高‘凤丹’叶片干旱胁迫期间的CAT活性，各干旱胁迫期内，随着喷施浓度的增加，CAT活性呈先增加后降低趋势，其中高质量浓度COS(40～80 mg/L)的喷施可显著提高叶片CAT活性(P<0.05)，且当外源COS喷施质量浓度为40 mg/L时，提高效果最明显。综合分析可知，外源COS喷施质量浓度超过40 mg/L时，对干旱胁迫下‘凤丹’叶片SOD、POD、CAT活性的增强效果较佳。

图3 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片SOD、POD、CAT活性的影响Fig.3 Effects of COS on SOD,POD and CAT activities of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

2.6 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片渗透调节物质含量的影响

由COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片SS、SP、Pro含量的影响情况(图4)可知，相同浓度COS处理下，‘凤丹’叶片中SS、SP、Pro含量均随着干旱程度的增加呈先升高后降低趋势；喷施不同质量浓度COS后，相同干旱程度‘凤丹’叶片中的SS、SP、Pro含量随着COS溶液质量浓度的增加呈逐渐升高趋势。在干旱胁迫下，喷施高质量浓度的COS(40～80 mg/L)可显著提高‘凤丹’叶片的SS、SP、Pro含量(P<0.05)，但各处理间差异不显著(P>0.05)。干旱7～9 d时，喷施不同质量浓度COS对‘凤丹’叶片中SS含量无显著影响(P>0.05)，随着干旱程度的增加，干旱11 d后，喷施COS可显著提高‘凤丹’叶片中SS含量(图4A)。干旱7～9 d时，与CK相比，喷施20 mg/L COS对‘凤丹’叶片中SP含量无显著影响(P>0.05)，高质量浓度的COS(40～80 mg/L)可显著提高‘凤丹’叶片中SP含量，且高质量浓度间无显著差异(图4B)。干旱7 d时，喷施不同质量浓度COS对‘凤丹’叶片中Pro含量无显著影响(P>0.05)，随着干旱程度的增加，与CK相比，不同质量浓度COS均显著提高‘凤丹’叶片中Pro含量(图4C)。综合分析可知，干旱胁迫下，喷施COS可提高‘凤丹’叶片中的SS、SP、Pro含量，当喷施质量浓度超过40 mg/L时，提高效果显著(P<0.05)，本着降低生产成本的原则，建议喷施质量浓度采用40 mg/L。

图4 COS对干旱胁迫下‘凤丹’叶片SS、SP、Pro含量的影响Fig.4 Effects of COS on SS,SP and Pro contents of P.ostii ‘Feng Dan’ under drought stress

3 讨 论

1) 壳寡糖(COS)是一种带正电荷阳离子碱性氨基低聚葡萄糖，被称为自然界的“天然活性产物”，凭借高效、无毒、来源广、易降解的优势被大量用于农业生产[17-18]。景红娟等[19]研究表明COS可显著增加小麦(Triticumaestivum)幼苗的生物量，有效促进小麦根、苗和胚芽鞘的生长发育，提高幼苗成活率。Lin等[20]研究发现叶面喷施适宜浓度的COS能有效促进黄芪(Astragaliradix)植株及根系的生长，使苗和根粗壮，须根数减少。本研究结果也表明喷施外源COS能增加干旱胁迫下‘凤丹’的苗高，促进根系发育变粗，提高地上部与地下部的生物量，促进‘凤丹’幼苗的生长发育，增加幼苗生物量。此外，本研究还发现，不同COS处理效果存在差异，结合生产实际，40 mg/L效果最佳。

水是植物体重要的结构成分，在植物体新陈代谢过程中发挥着不可替代的作用。李思等[21]研究发现在自然干旱条件下多次向叶面喷施COS能显著提高玉米叶片的相对含水量，本研究结果与其一致，且本研究发现喷施40 mg/L外源COS可显著增加干旱胁迫下‘凤丹’叶片的相对含水量。叶绿素是植物进行营养生长、生殖生长和抗逆生长的关键成分，其含量的高低在很大程度上反映了叶片光合作用的强弱[22]。本研究发现，喷施外源COS可显著增加干旱胁迫下‘凤丹’叶片的叶绿素含量，有效提高叶片净光合速率，以40 mg/L COS效果最佳，该结果与郭卫华等[23]和李艳等[24]的研究结果一致。

2) 植物在长期演化过程中形成了一套有效的酶促清除活性氧系统，通过刺激植物体内SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性增加，清除过多的自由基，维持活性氧产生与清除的动态平衡，减轻植物细胞膜脂过氧化，从而提高对逆境(干旱、高温、盐渍和重金属污染等)胁迫的抵抗能力[25]。本研究中随着干旱胁迫的不断加剧，‘凤丹’叶片的MDA和H2O2含量逐渐增加，SOD、POD、CAT活性均表现为先大幅升高后缓慢降低趋势，说明干旱胁迫下，‘凤丹’幼苗能通过自身调节机制，提高抗氧化系统相关酶活性，清除部分活性氧自由基，但由于自身调节能力有限，无法完全清除体内过量的自由基，使其不可避免地遭受到氧化胁迫损伤。喷施COS能在一定程度上提高‘凤丹’叶片的SOD、POD和CAT活性，降低MDA和H2O2含量，减轻膜质过氧化程度，缓解干旱胁迫对‘凤丹’幼苗造成的氧化伤害作用，这与李伟等[26]在野牛草(BuchloedactyloidesNutt.)上的研究结果类似。孙君艳等[27]研究了壳寡糖对干旱胁迫下花生(ArachishypogaeaLinn.)幼苗叶片保护酶的影响，也表明外施COS能增强幼苗叶片保护酶(SOD、POD、CAT)的生理活性，减轻干旱造成的伤害，从而增强幼苗的抗旱能力。

植物组织中的SS、SP和Pro是植物体内重要的渗透调节物质，植物抵抗外界胁迫的能力与SS、SP、Pro等渗透调节物质的含量密切相关[28]。研究表明轻度干旱下，SS可作为小分子物质参与渗透调节，SP可参与植物体内各种代谢，Pro能促进蛋白质的水合作用，形成具有一定保水能力的聚合物，维持细胞内环境稳定，同时还能作为细胞膜和酶类的保护物质及自由基清除剂，维持细胞渗透平衡[29-30]。李军等[31]研究表明逐渐干旱胁迫下，随着水分胁迫程度增加，‘洛阳红’(P.suffruticosa‘Luoyang Hong’)和‘乌龙捧盛’(P.suffruticosa‘Wulong Pengsheng’)牡丹叶片的SS、SP含量均呈逐渐升高的趋势，而本研究中随干旱程度的增加，‘凤丹’叶片中SS和SP含量均呈先升高后降低趋势变化，这可能是由于干旱程度加重，叶片细胞膜质过氧化反应加快，膜结构遭到破坏而失去半透性，胞内氨基酸、糖类等物质大量外渗，最终导致叶片SS、SP含量降低。本研究中，不同浓度COS溶液处理后，‘凤丹’叶片SP、SS、Pro含量均高于对照，且当喷施质量浓度超过40 mg/L时，提高效果明显，这说明适宜浓度的外源COS处理能增加植物体内渗透物质的含量，对提高细胞渗透调节能力、维持细胞渗透平衡和保护细胞膜完整性有重要促进作用，该结果与马莲菊等[32]在小麦上的研究一致。

综上，干旱胁迫下喷施COS能促进‘凤丹’幼苗生长，提高叶片相对含水量、净光合速率和叶绿素含量，提高抗氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性，提高可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，降低丙二醛和过氧化氢含量，且在本试验中，喷施质量浓度为40 mg/L时，即可降低成本，又能增加收益。