张希涛，葛春蕾，彭井华，贾新华

1山东中医药大学，济南 250014；2山东中医药大学附属医院，济南 250011

结缔组织相关间质性肺病(connective tissue disease-associated interstitial lung disease，CTD-ILD)是指患者在自身免疫性疾病基础上并发有肺部间质性病变。结缔组织病(CTD)主要病理变化为疏松结缔组织发生黏液性水肿、类纤维蛋白变性、小血管坏死和组织损伤，肺内由于含有丰富的胶原、血管等结缔组织,并具有免疫调节、代谢、内分泌等功能,常成为CTD累及的重要靶器官[1]。一项2 000例结缔组织病患者随访20年的研究表明，CTD-ILD的预后比没有并发间质性肺病(ILD)的CTD患者更差，肺疾病占CTD全部死因的21.5%，其中ILD占其中的46.7%，ILD明显降低了CTD患者的生存率[2]。现阶段，对于CTD-ILD的治疗多选用激素+免疫抑制剂的治疗方案，但不良反应较多并伴有多种并发症，且临床统计的效果具有明显的差异性，总体来说并不令人满意[3]。

雷公藤(Tripterygiumwilfordii)为卫矛科雷公藤属植物，其性寒，味苦，有大毒，归属心、肝、胃、肾四经，具有祛风除湿、通络止痛等功效。现代药理学研究[4]认为，雷公藤具有有抗炎、调节免疫、镇痛、抗肿瘤、抗血管生成、保护神经、保护关节软骨等多种药理作用。临床多用于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、急慢性肾小球肾炎等自身免疫性疾病的治疗。然而，对于其在CTD-ILD中的应用并未引起广泛重视，尤其是关于其分子机制的研究多局限在单一成分、靶点、通路上，未曾系统性的评估雷公藤在CTD-ILD疾病网络中所发挥的作用。

为进一步研究雷公藤干预CTD-ILD的作用机制，笔者在课题组前期研究的基础上[5-7]，运用网络药理学及分子对接技术等现代生物信息学技术，从雷公藤的物质成分出发，着眼于整体角度分析雷公藤干预CTD-ILD的分子机制，同时为后续研究提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 雷公藤主要活性成分及作用靶点的筛选

通过TCMSP数据库[8](http://tcmspw.com/tcmsp.php)获取雷公藤的化学组成成分，根据ADME属性值筛选出生物活性较高的成分，设置筛选参数为：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30，类药性(drug-like，DL)>0.18，氢键给体(hydrogen bond donors，Hdon)≤5，氢键受体(hydrogen bond acceptors，Hacc)≤10。筛选完成后，在TCMSP数据库进行靶标预测，并根据已发表的文献报道补充雷公藤的化学成分[9,10,11]，在Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch)进行靶点预测。筛选结束后，统一在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将化合物的靶点蛋白进行规范化处理，得到对应的靶点基因名称。

1.2 CTD-ILD相关靶点基因筛选

以“Connective Tissue Disease-associated Interstitial Lung Diseases ”作为检索关键词，通过OMIM数据库(http://www.omim.org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org)挖掘与CTD-ILD相关的潜在靶点，进入DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)寻找已经获准使用的干预CTD-ILD的西药作用靶点予以补充[12]。合并3个疾病数据库靶点，删除重复值得到CTD-ILD相关靶点。

1.3 雷公藤成分-CTD-ILD靶点(PPI)网络构建

通过R x64 4.0.0软件将雷公藤作用靶点与CTD-ILD靶点取交集并绘制韦恩图。提取交集靶点提交至STRING数据库(https://string-db.org)，构建蛋白互作网络(PPI)模型[13]。将物种类型设定为“Homo sapiens”，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(> 0.9)，隐藏游离蛋白，余均为默认设置。得到PPI网络后，通过CytoScape3.8.0对PPI网络进一步分析，提取关键的蛋白质功能模块，并描述其参与的生物进程及功能。

1.4 GO及KEGG富集分析

通过Metascape平台(http://metascape.org/gp/index.html)对雷公藤干预CTD-ILD的潜在靶点进行GO及KEGG生物富集分析。保存数据结果并运用R语言进行可视化分析。

1.5 雷公藤活性成分-靶点-CTD-ILD信号通路网络图的构建

运用CytoScape3.8.0构建“雷公藤活性成分-靶点-CTD-ILD信号通路图”，并利用CytoScape 3.8.0内置工具分析雷公藤有效成分及靶点的网络拓扑参数，并根据网络拓扑学参数筛选出核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.6 分子对接验证

对“成分-靶点-通路”网络中度值(degree)排名前4的活性成分与靶点进行分子对接，从PDB数据库(https://www.rcsb.org)下载靶点蛋白的3D结构，并寻找与小分子相似的独特配体作为原配体(活性口袋位点)。靶点蛋白通过PyMOL移除水分子及原配体，导入AutoDock Tools 1.5.6 进行加氢、计算电荷、合并非极性氢后保存成.pdbqt格式，合并非极性氢后保存成.pdbqt格式。设置Grid Box大小为40×40×40，最后，使用CMD命令字符运行AutoDock Vina进行分子对接[15]，用PyMOL对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 雷公藤主要活性成分靶点的获取

通过TCMSP平台共获取雷公藤化学成分144种，经ADME筛选后得到活性成分42种，剔除没有对应靶点蛋白的13个，剩余活性成分29个，包括雷公藤甲素、雷公藤内酯醇、β-谷甾醇等，文献补充Tripterinin[10]。为方便后续绘图及数据处理，予以标记(见表1)。雷公藤各成分对应靶点424个，合并删除重复值后共得到靶点136个。

表1 雷公藤主要成分

续表1(Continued Tab.1)

2.2 CTD-ILD相关靶点的获取

在Genecards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系越密切。根据文献[14]，当靶点过多时设定Score大于中位数的目标靶点为CTD-ILD相关靶点，通过GeneCards所得靶点的Score最大值为119.41，最小值为0.49，中位数为11.38，故设定Score>11.38的基因靶点为CTD-ILD的相关靶点，筛选后共得到1 032个。从OMIM数据库中，共获取520个靶点。DrugBank数据库检索中以尼达尼布的作用靶点予以补充，共21个。合并3个数据库并剔除重复值，最终得到1 496个CTD-ILD相关靶点。

2.3 PPI网络构建

将雷公藤活性成分靶点与CTD-ILD疾病靶点取交集，通过R语言绘制韦恩图，得到交集靶点共80个(见图1)。将交集靶点提交至STRING平台，构建PPI网络(见图2)，并通过CytoScape3.8.0中的MCODE插件进行分子复合物预测，提取PPI网络中具有重要生物学意义的蛋白功能模块(module，见图3)。根据P值，选择PPI网络中3个评分最佳的MCODE对其生物功能进行描述(见表2)。由结果可见，其功能主要涉及炎症因子，癌症通路及参与多种细胞凋亡。

2.4 GO及KEGG分析

应用Metascape平台对雷公藤干预CTD-ILD相关靶点进行GO，KEGG的富集分析，借助R语言对结果进行可视化处理。由结果可见多个靶点的功能与CTD-ILD的发生密不可分。其中，GO富集分析共得到了3 740个GO条目(P<0.01，FDR<0.01),其中生物过程条目1 559条，涉及炎症、免疫、代谢、细胞因子介导、生物调节等。分子功能相关条目2 000条，包括抗氧化、激素调节、抗肿瘤、抗炎、分子功能调节、转录活性调节等。细胞组成相关条39条，包括细胞外基质、线粒体膜、突触后膜、膜筏等。

图1 雷公藤-CTD-ILD靶点韦恩图Fig.1 The venn diagram of T.wilfordii and CTD-ILD targets

图2 雷公藤-CTD-ILD潜在靶点PPI网络Fig.2 Potential target gene PPI(protein interaction)network of T.wilfordii and CTD-ILD

图3 潜在靶点PPI网络中的ModuleFig.3 Modules of Potential target gene PPI network

表2 MCODE功能描述

KEGG富集条目共142条(P<0.01，FDR<0.01)，包括与炎症及免疫相关的IL17信号通路(IL-17 signaling pathway)、Th17细胞分化通路(Th17 cell differentiation)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)等；与氧化应激相关的HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)等；癌症相关通路，如Cancer信号通路(pathways in cancer)、非小细胞肺癌信号通路(non-small cell lung cancer)、结直肠癌信号通路(colorectal cancer)等，以及其他蛋白酶，细胞凋亡相关信号通路。对于GO及KEGG富集结果，根据P值，对前20条相关富集结果进行可视化(见图4)。

图4 雷公藤主要成分潜在靶点的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of potential targets of main components in T.wilfordii注：A：GO-CC分析；B：GO-BP分析；C：GO-MF分析；D：KEGG分析。Note:A:GO-CC analysis;B:GO-BP analysis;C:GO-MF Analysis;D:KEGG analysis.

2.5 成分-靶点-信号通路网络的构建

通过CytoScape3.8.0构建“成分-靶点-信号通路”网络(见图5)。运用CytoScape3.8.0内置的NetworkAnalyzer分析通路网络的拓扑学参数，提取核心活性成分及核心靶点。成分-靶点-信号通路网络分析结果显示，网络中共有130个节点，形成了575个关系对。其中，山奈酚连接度(dgree)为34，介度(betweenness centrality)为0.211 545 2，紧密度(closeness centrality)为0.47426471，预测其是干预CTD-ILD中的重要成分，其次为雷公藤内酯醇、川陈皮素、β-谷甾醇等(见表3)。PTGS2连接度26，介度0.153 926 47，紧密度0.507 874 02，预测其是雷公藤干预CTD-ILD的重要靶点，JUN、MAPK8、RELA、SCN5A、TNF等亦为相对重要的靶点(见表4)。

2.6 分子对接结果

对雷公藤核心成分与关键靶点进行分子对接，对接结果示(见表5)，分子亲和力(affinity)< -5 kcal/mol的占93.75%，表示有较好的结合活性，分子亲和力< -7 kcal/mol的占62.5%，山奈酚与3V3V的亲和力最高，为-8.6 kcal/mol,显示化合物与靶点之间具有良好的对接活性[16]；而其中5次对接结果显示，部分化合物与靶点受体之间的亲和力超过了原配体，分别是：山奈酚与3QXY，山奈酚与5T01，雷公藤内酯醇与3QXY，川陈皮素与5T01，β-谷甾醇与3QXY)(见图6)，这一部分化合物可能通过竞争性抑制原配体与靶点受体的结合而影响其功能，在CTD-ILD中发挥重要作用。

图5 雷公藤成分-CTD-ILD靶点-信号通路网络Fig.5 Constituents of T.wilfordii and CTD-ILD target and signal pathway network注：六边形代表药物成分；菱形代表靶点；圆形为通路。节点的面积及颜色透明度代表其度值，面积越大、颜色越深说明该节点越重要。Note:Hexagon represents drug composition;Rhomboid represents target;Circle represents pathway.Area and color transparency of nodes represent degree value,larger area and deeper color indicate more important node.

表3 雷公藤核心成分

图6 分子对接模型Fig.6 Molecular docking model注：A：川陈皮素—5T01；B：雷公藤内酯醇—3QXY；C：β-谷甾醇—3QXY；D：山奈酚—5T01；F：山奈酚—3QXY)。Note:A:Nobiletin-5T01;B:Triptolide-3QXY;C:β-Sitosterol-3QXY;D:Kaempferol-5T01;F:Kaempferol-3QXY).

表5 分子对接结果

3 讨论

结缔组织相关间质性肺病(CTD-ILD)在古代中医文献中并未有具体的命名，结合本病的临床表现及病因病机可将其归属为“肺痹”的范畴，《内经》中最早简述了肺痹的临床表现及病因，如《素问·痹论篇》曰:“五脏皆有所合，病久而不去者，内舍于其合也，……皮痹不已，复感于邪，内舍于肺；所谓痹者，各以其时重感于风寒湿之气也；凡痹之客五脏者，肺痹者，烦满喘而呕；淫气喘息，痹聚在肺”，又曰：“其入脏者死，其流连筋骨间者疼久，其留皮肤间者易已”，论述本病病情较重，预后差；目前西医大多应用糖皮质激素及免疫抑制剂治疗，但其不良反应实多并伴有多种并发症，治疗效果不甚理想；随中医药文化蓬勃发展，中医药通过运用整体观念、辨证论治的原则在多种疾病治疗中的优势凸显，同时中药主要来源于天然的动植物、矿物及其加工品等，有效成分众多。多项研究证实，中医药在CTD-ILD的治疗中具有独特的优势。Qu等[7]从中医整体观及现代医学的角度出发，基于“伏毒学说”论治，提出了扶正益气托毒、化痰通络解毒两种治法，此外本课题组还论述了雷公藤在不同类型的结缔组织相关间质性肺病中的临床应用及作用机理[5,6]。基于上述理论研究，本篇基于网络药理学及分子对接技术进一步探讨雷公藤干预CTD-ILD的分子机制，为雷公藤用于本病治疗提供理论依据，并期待能为新药的研究提供方向。

笔者运用网络药理学研究方法筛选出雷公藤有效活性成分29个，预测作用靶点136个，其中与CTD-ILD相关的靶点80个，占总靶点的59%，说明雷公藤对于CTD-ILD的治疗具有极高的针对性，可以通过多成分、多靶点联合发挥治疗作用，在CTD-ILD的治疗中有一定的研究价值；根据PPI及“成分-靶点-通路”网络的拓扑属性分析结果，得到排名前5的关键化合物分别为山奈酚、雷公藤内酯醇、川陈皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。

山奈酚属于黄酮类化合物，广泛存在于各种植物中。现代药理学研究表明，山奈酚具有抗癌、防癌、抗炎、抗氧化、抗菌等作用。Wang等[17]研究发现，山奈酚在体外可以以非竞争性的方式抑制钙调磷酸酶(CN)的活性，后者是一种高度保守的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，其参与细胞因子介导的T细胞活化，在免疫调节过程中发挥重要的作用，同时，山奈酚还能抑制Jurkat细胞中IL-2基因的表达，发挥了免疫抑制的作用。川陈皮素具有抗炎、抗癌、抗突变、抗血栓形成、抗胆碱酯酶等作用，Zheng等[18]研究发现，川陈皮素使细胞线粒体膜电位下降并随时间延长，Akt、p-Akt蛋白表达下调呈时间依赖性，从而得出川陈皮素可以通过线粒体途径抑制PI3K/Akt信号通路的激活，而PI3K/Akt信号通路通过刺激成纤维细胞增殖、促进纤维分泌及胶原沉积等在肺纤维化“损伤-修复”这一中心环节中发挥重要作用。雷公藤内酯醇是一种环氧二萜内酯化合物，其在抗氧化，抗类风湿，抗老年性痴呆症，抗癌等方面发挥重要作用，同时被广泛认为是雷公藤最主要的抗炎和免疫抑制成分[19]。相关药理研究认为，雷公藤内酯醇可以通过调控MAPK和VEGF等信号转导通路下调TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，发挥抗炎作用，Hu等[20]通过网络药理学角度阐明雷公藤内酯醇抗风湿作用机制为通过调节MAPK信号转导通路来抑制炎性细胞因子的产生和调节VEGF信号转导通路在关节抑制细胞因子的表达，来减少胶原蛋白的产生、抑制滑膜细胞增殖、减弱侵袭能力等。实验观察发现[21]，豆甾醇和β-谷甾醇均可通过显著降低非酒精性脂肪肝细胞内MDA含量、提高GSH水平，减轻脂质蓄积造成的肝细胞的过氧化损伤，增强细胞的解毒功能，其具有较强的抗氧化活性，可较好地改善细胞脂质沉积所引起的氧化应激状态。综上分析，这些关键化合物成分大多具有抗炎、抗癌、抗氧化、免疫抑制等作用，这提示雷公藤可能通过抗炎，抗氧化，免疫抑制等途径起到治疗CTD-ILD的作用。

富集分析的结果显示，IL17信号通路、TNF信号通路、Cancer信号通路等是雷公藤干预CTD-ILD的重要通路，其他还包括Th17细胞分化通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路、非小细胞肺癌信号通路、结直肠癌信号通路等，主要涉及炎症相关、免疫相关、氧化应激及肿瘤等。其中IL17可以促进肺成纤维细胞的增殖及向肌成纤维细胞的转化，并且能够促进Ⅰ、Ⅲ胶原蛋白的合成，进而加快肺纤维化的进程[22]。TNF-α参与了肺纤维化的急性炎症反应，可以促进Ⅱ型肺泡细胞的凋亡，从而抑制肺损伤的修复[23]，同时，TNF-α可以诱导成纤维细胞大量聚集，胶原合成增加[24]。研究结果还表明，诸多癌症相关通路参与了肺纤维化的进程，如Wnt/β-catenin信号通路不仅参与肿瘤发生发展，同时也参与肺纤维化的进展，有证据表明Wnt1可诱导信号蛋白-1(WISP1)是肺泡上皮II型细胞增生的关键调节因子，同时也是抗纤维化治疗重要靶点[25]，并且是治疗肺纤维化合并肺癌有希望的靶点之一。

雷公藤干预CTD-ILD治疗的主要靶点为PTGS2。其中前列素内环氧化物合成酶(prostaglandin endoperoxide synthase，PTGS)，又称环氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是花生四烯酸合成前列腺素的关键限速酶，分为结构型COX-1与诱导型COX-2。Yang等[26]通过实验研究发现，COX-2 在博莱霉素肺纤维化组织中有高度表达，主要分布于细支气管上皮细胞，其能上调PEG2的表达，进而导致Th1/Th2型细胞因子的平衡失调，刺激体内炎症介质的产生，加速肺纤维化进程。我们的研究还发现，CTD-ILD中多个重要基因与肿瘤密切相关，如PTGS2、JUN、TNF等。无论是从靶点亦或是信号通路角度，肿瘤与CTD-ILD都具有明显的相关性，与KEGG富集结果相符。最后分子对接的结果也验证了本次研究结果的可靠性。

依据本次研究结果，雷公藤可以通过多靶点、多通路的联合干预CTD-ILD的进程，其关键化学成分为山奈酚、雷公藤内酯醇、川陈皮素、β-谷甾醇、豆甾醇，关键靶点为为PTGS2、JUN、MAPK8、RELA等。鉴于雷公藤与CTD-ILD的相关研究不足，缺乏更多证据支持，后续将在此基础上进行动物及细胞实验的验证，对于CTD-ILD的治疗仍需广大科研工作者进行更多的基础性及临床性的深入研究；同时期待本研究预测结果能为研发新药或新的治疗手段提供方向。