王海珊 邹 平# 叶敬旴 包本涛 杨常亮 毕晓伊 王 洁

(1.云南大学生态与环境学院，云南 昆明 650091；2.云南大学国际河流与生态安全研究院，云南 昆明 650091；3.云南省高原山地生态与退化环境修复重点实验室，云南 昆明 650091；4.云南省国际河流与跨境生态安全重点实验室，云南 昆明 650091)

大量污染物进入水体，分解代谢消耗溶解氧，导致水体厌氧或缺氧，产生H2S、NH3等气体，同时形成FeS、MnS等黑色物质，从而形成黑臭水体[1]。黑臭水体不仅影响城市景观，且对人体健康存在危害[2-3]。黑臭水体的治理方法主要有物理法、化学法及生物法。近年来，生物法由于具有处理量大、成本低、无二次污染等[4]诸多优点被广泛应用于黑臭水体的治理。生物法主要包括微生物强化法、植物吸收法等。

微生物强化法是一种通过投加菌剂、促生剂等手段，使水体中微生物的多样性及生物量迅速提高，形成一定的菌群规模[5]，从而强化微生物对污染物降解作用的方法。投加菌剂是黑臭水体治理中极为常用的微生物强化法，目前主要集中于土著菌剂及工程菌剂两大类型的研究。如杨文娟[6]利用目标黑臭水体富集培养光合菌剂及反硝化菌后制成土著菌剂，用于净化黑臭水体后，TN、TP、COD去除率分别达到55.30%、42.68%、57.67%。庄景等[7]运用工程菌剂处理无锡市浒溪河水体，其对氨氮、TP、COD去除率分别达到58.00%、56.00%、43.00%。

土著菌剂及工程菌剂均是通过人为手段筛选并富集培养某些具有较强污染物降解特性的功能菌群后，按一定比例配制而成的菌剂。两种菌剂菌种来源不同，对黑臭水体的适应性、净化效果等也可能产生差异。但目前对于两大类型菌剂对黑臭水体适应性、净化效率及机制的比较研究尚少。故本研究以云南省昆明市晋宁区晋城百花街东干河为目标黑臭水体，选用土著菌剂及工程菌剂代表各1种进行黑臭水体净化实验，并进行高通量测序分析两种菌剂净化黑臭水体后的微生物群落结构，比较两种菌剂对黑臭水体的适应性、净化效率差异，并从微生物的角度分析差异产生的原因，从而对两种菌剂对黑臭水体的净化机制进行初步探讨，为黑臭水体治理工作中更科学地选用菌剂提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 微生物菌剂

利用东干河黑臭水分别富集培养硝化菌、酵母菌、光合菌、放线菌，培养期间每天监测4种菌的生长状态，当达到对数生长期时，参照前期研究结果，迅速按3∶3∶3∶4的体积比混匀[8]125，配制成土著菌剂A(本实验室自主研发)，为保证微生物保持较高活性，避免微生物进入衰亡期影响实验结果，土著菌剂A需现配现用。工程菌剂B为某环保公司生产的工程菌剂，其主要组成菌种为植物源枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)、梭菌(Clostridium)、乳酸菌(Lactobacillus)、厌氧绳菌(Anaerolinea)等。

1.2 实验样品

实验所需水样和底泥取自云南省昆明市晋宁区晋城百花街东干河，该河道流速较低，且常年黑臭，河道周围有较多居民居住，并分散着各种中小企业，是典型的乡镇复合型污染河道。将该黑臭河道的水样及底泥混匀静置2 h后，测定黑臭水体背景值，结果见表1。

表1 黑臭水体背景值Table 1 Black-odorous water background values

1.3 实验方法

1.3.1 确定工程菌剂的最佳投加量

两种菌剂对黑臭水体的净化实验均需在最佳投加量下进行。由前期实验可知，土著菌剂A最佳投加量为50 ml/L[8]127。工程菌剂B最佳投加量通过单因素实验得到：投加量依次设置为0.1、0.5、1.0、5.0、25.0 g/L；实验在摇瓶机(ZHWY-2102C)中进行，温度为25 ℃，转速为120 r/min；每天定时取样，分别测定1个实验周期内(实验周期的时间长短依据指标去除率而定，当指标去除率稳定时，则实验结束，所有实验均如此)氨氮、TP和COD的去除率；每个实验重复操作3次。

1.3.2 不同菌剂在最佳投加量状态下对黑臭水体的净化效果

本实验设置3个实验组，分别按最佳投加量加入土著菌剂A及工程菌剂B，空白组不加菌剂。实验在摇瓶机中进行，温度为25 ℃，转速为120 r/min。每天定时取样，分别测定1个实验周期内氨氮、TP和COD的去除率，比较3个实验组对氨氮、TP和COD去除率的差异，并探究产生差异的原因。

1.4 水质指标测定方法

实验过程中，每天定时取上清液，将其放入离心机(Allegra X-30R)中(8 000 r/min，-4 ℃)离心5 min，取上清液测定TP、COD、氨氮。TP、COD、氨氮分别采用钼酸铵分光光度法、重铬酸钾法、纳氏试剂分光光度法测定[9]。

1.5 微生物群落结构多样性分析方法

本实验通过高通量测序分析细菌、真菌群落结构多样性，以期从细菌、真菌角度理解不同菌剂对黑臭水体净化效率产生差异的原因。净化实验结束后，分别取3个实验组泥水混合物各50 mL，放入离心机(12 000 r/min，-4 ℃)离心10 min，收集离心沉淀物并做好标记，-80 ℃保存，送至上海某生物医药科技有限公司进行高通量测序。3个实验组样品使用该生物医药科技有限公司的DNA提取试剂盒进行DNA提取，在确定提取的DNA样品满足上机测序的用量需求后，用通用引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)扩增细菌16S rDNA的V4～V5区。用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)扩增真菌ITS的ITS1区。扩增结束后对聚合酶链式反应(PCR)产物进行纯化，纯化后的产物通过MiSeq平台完成测序。预处理过程中各参数的设置详见参考文献[10]。

1.6 数据分析方法

数据采用Origin 8.0软件及I-Sanger云平台分析。

2 结果与讨论

2.1 不同菌剂对黑臭水体的净化效率

2.1.1 工程菌剂B的最佳投加量

不同投加量下工程菌剂B对黑臭水体的净化效果见图1，当投加量为5.0 g/L时，工程菌剂B对黑臭水体中氨氮、TP、COD的去除率最大，分别达到55.32%、75.57%、45.92%。在一个实验周期内，随着工程菌剂B投加量的增加，其对黑臭水体中氨氮、TP、COD去除率大体呈先升高后降低趋势。这可能是因为菌剂投加量过大时，培养体系的养分有限，微生物之间存在激烈的生存竞争，经过较短时间的生长繁殖后，菌群迅速进入衰亡期，大量微生物死亡，净化能力下降。

图1 不同投加量下的去除率Fig.1 Removal efficiency under different dosages

2.1.2 两种菌剂对黑臭水体的净化效率

由图2可知，1个实验周期内，空白、工程菌剂B、土著菌剂A的氨氮去除率分别为25.32%、51.32%、92.39%，TP去除率分别为71.05%、72.57%、89.29%，COD去除率分别为9.52%、43.92%、62.93%。3个实验组对3个指标的去除率表现为土著菌剂A>工程菌剂B>空白。相较于空白，菌剂对氨氮、TP、COD的去除率均有不同程度的提升，这说明投加菌剂对于强化黑臭水体污染物去除是必要的，这也是目前其被广泛应用于黑臭水体治理的原因。

图2 不同菌剂处理下的去除率Fig.2 Removal efficiency under different microbial agent treatments

在实验初期土著菌剂A对TP、COD就有较高的去除率，而工程菌剂B对其去除率较低。6 d时，土著菌剂A对氨氮、TP、COD的去除率与工程菌剂B相比分别高41.07百分点、16.72百分点、19.01百分点，净化效果明显优于工程菌剂B。这可能是因为土著菌剂A的菌种来自于目标黑臭水体，其世代生存于目标黑臭水体中，已完成驯化及演替过程，对目标黑臭水体具有极强的适应性及耐受性，能在短时间内快速适应黑臭水体的极端恶劣环境，快速降解污染物，故在实验初期即呈现出较高的去除率，且一直处于领先状态。工程菌剂B的菌种并非来自于目标黑臭水体，当其投入目标黑臭水体中时，微生物需要适应新的环境，其生长繁殖有一个较长的延迟期，故在实验初期呈现出较低的污染物去除率，随着实验时间的延长，微生物逐渐适应新的生存环境，逐渐发挥净化作用，污染物去除率也逐渐提高，但其去除率在有效时间内始终低于土著菌剂A。

综上所述，土著菌剂A对黑臭水体适应性更高，可在短时间内迅速降解污染物。工程菌剂B延迟期较长，需要适应一定时间，污染物去除率才逐渐提高，但去除率始终低于土著菌剂A。因此，土著菌剂A应用于黑臭水体的净化，可缩短黑臭水体的修复周期。

2.2 不同菌剂处理下微生物群落结构比较分析

2.2.1 不同菌剂对微生物多样性的影响

系统中微生物的多样性及生物量与系统的净化效率、稳定性等相关，本实验测定了各实验组样品的Alpha 多样性，结果见表2。由表2中 Coverage指数可知，3个样品的覆盖率基本无差异，覆盖率均超过99%，说明本次测序深度足够反映样品中细菌的真实情况。由Chao1指数和Ace指数可知，细菌群落丰富度表现为工程菌剂B>空白>土著菌剂A。由Shannon指数和Simpson指数可知，细菌群落多样性表现为工程菌剂B>空白>土著菌剂A。

表2 细菌Alpha多样性指数Table 2 Bacterial Alpha diversity index

土著菌剂A的细菌群落多样性最低，但其对污染物去除率却最高，说明不是所有微生物具有污染物去除作用，土著菌剂A处理可能使具有污染物降解特性的优势功能微生物菌群发生群聚，强化功能微生物对污染物的降解，从而使土著菌剂A对黑臭水体净化效果较佳。

工程菌剂B中细菌群落多样性及丰富度最高，与空白有一些差异但差异较小，提示工程菌剂B可能引入了少量新的微生物，由于工程菌剂B中的微生物对目标黑臭水体的适应性较差而未能在实验期内大量增长，也就未能发挥较强的净化作用，所以其净化效率不如土著菌剂A。

由表3中Coverage指数可知，3个实验组样品的覆盖率差异不大，覆盖率均在97%以上，说明本次测序深度足够反映样品中真菌的真实情况。由Chao1指数和Ace指数可知，真菌群落丰富度表现为空白>工程菌剂B>土著菌剂A。由Shannon指数和Simpson指数可知，土著菌剂A与工程菌剂B的真菌群落多样性相似且高于空白。这说明两种菌剂处理下真菌群落多样性均有一定提高。土著菌剂A对黑臭水体的净化效率显著高于工程菌剂B，这说明后者的真菌微生物由于对目标黑臭水体的适应性较差未发生较强的净化作用。

表3 真菌Alpha多样性指数Table 3 Fungus Alpha diversity index

综上所述，土著菌剂A可使具有污染物降解特性的优势功能微生物群落发生群聚，强化功能微生物对污染物的降解作用；工程菌剂B可使细菌群落多样性及丰富度提高，但由于对目标黑臭水体的适应性较差而细菌未能大量增长。土著菌剂A、工程菌剂B均可使真菌多样性提高，但前者由于对目标黑臭水体具有较强的适应性而有较高的净化效率。

2.2.2 不同菌剂对微生物群落结构的影响

为进一步理解各实验组对黑臭水体净化效果产生差异的原因，从门水平及属水平分析各实验组的微生物群落结构。

细菌在门水平上的相对丰度见图3(a)。工程菌剂B中优势物种为变形菌门(62.66%)、厚壁菌门(16.24%)、放线菌门(10.29%)、拟杆菌门(6.29%)；土著菌剂A中优势物种为变形菌门(68.94%)、厚壁菌门(14.56%)、拟杆菌门(7.58%)、放线菌门(7.09%)；这些微生物已被认定为污水处理系统中常见的优势物种[11-13]，在污水处理中发挥着重要作用。与工程菌剂B相比，土著菌剂A中的变形菌门、拟杆菌门相对丰度均有所提高。变形菌门具有脱氮除磷降解有机物的能力[14]；拟杆菌门在产酸阶段起重要作用，其所含的某些菌属具备降解碳水化合物、COD的能力[15]。这可能是土著菌剂A净化效果较好的原因之一。

真菌在门水平上的相对丰度见图3(b)。工程菌剂B中优势物种为子囊菌门(68.83%)、担子菌门(22.43%)、罗兹菌门(4.47%)、被孢霉菌门(4.22%)；土著菌剂A中优势物种为子囊菌门(66.90%)、担子菌门(27.03%)、罗兹菌门(3.40%)、毛霉菌门(2.16%)；这些微生物已被认定为污水处理中主要的真菌[16-17]。工程菌剂B与土著菌剂A中子囊菌门相对丰度均在66%以上。资料显示，子囊菌门是真菌中最大的类群，其对纤维素及木质素具有降解能力[18]；与工程菌剂B相比，土著菌剂A中担子菌门相对丰度提高，其对复杂的碳水化合物的降解起着重要作用，可以通过酶促反应来降解木质素[19-20]；毛霉菌门为土著菌剂A独有的优势物种，相对丰度达到2.16%，其具有较强的蛋白质降解能力。这也可能是土著菌剂A对黑臭水体净化效果较佳的原因。

图3 门水平的优势物种相对丰度Fig.3 Relative abundance of dominant microorganism in phylum level

细菌在属水平上的相对丰度排名前20的物种见表4。工程菌剂B中优势菌属为热单胞菌、短波单胞菌、苯基杆菌、寡养单胞菌、梭菌属、Chryseomicrobium、unclassifiedRhodobacteraceae、氨基杆菌、白色杆菌、拟杆菌属等；土著菌剂A中优势菌属为寡养单胞菌、短波单胞菌、微小杆菌、谷氨酸杆菌、明串珠菌、unclassifiedRhodobacteraceae等。与工程菌剂B相比，土著菌剂A中寡养单胞菌相对丰度高出28.01百分点。资料显示，寡养单胞菌为好氧菌，属于变形菌门，可用于废水处理及水体修复。吕志堂等[21]研究发现寡养单胞菌具有较高的脱氮除磷效率。胡起靖等[22]从福州某印染厂污水处理池的活性污泥中筛选分离得到寡养单胞菌，其具有较强脱色能力，脱色效率最高可达95.70%；此外，短波单胞菌、微小杆菌、谷氨酸杆菌、明串珠菌在土著菌剂A中的相对丰度也明显高于工程菌剂B。文献显示，短波单胞菌具备降解二甲双胍和吸附镉的能力；微小杆菌为兼性厌氧菌[23]，能在NaCl为0～12%(质量分数)的条件下生长，具有耐盐性[24]，在高盐度皮革废水中，对COD的去除率高达90.00%[25]；谷氨酸杆菌对邻苯二甲酸二丁酯的11 h降解率高达99.90%[26]；明串珠菌具备拮抗致病菌、高产酸及抗氧化能力。这些也是土著菌剂A对黑臭水体净化效果较好的原因。

表4 属水平的细菌相对丰度Table 4 Relative abundance of bacteria in genus level %

真菌在属水平上的相对丰度排名前20的物种见表5。工程菌剂B中优势菌属为Apiotrichum、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、Wallemia、Arthrographis、unclassifiedMortierellales、支顶孢属、unclassifiedRozellomycota、unclassifiedSordariomycetes、念珠菌等；土著菌剂A中优势菌属为Apiotrichum、Wallemia、unclassifiedAscomycota、曲霉菌、青霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、unclassifiedPleosporales、Talaromyces、Acaulium等。与工程菌剂B相比，土著菌剂A中Apiotrichum、Wallemia、曲霉菌、念珠菌、unclassifiedSordariomycetes、Talaromyces、unclassifiedPleosporales相对丰度较高。Apiotrichum、unclassifiedPleosporales在污水处理中的作用机制尚未有资料报道，因此其作用机制需进一步研究。据文献报道，Wallemia是污水中常见的真菌[27]，具有耐盐性；曲霉菌具备降解芳香族化合物、杀虫剂、除草剂阿特拉津及COD的能力[28]；念珠菌具备降解有机物及降低橄榄油厂废水毒性的能力[29]，在最适生长条件下，其对COD去除率可达84.10%[30]；Sordariomycetes可将 NO2还原为 N2O，促进了氮的去除[31]；Talaromyces对污水具有较好的净化作用，如FANG等[32]采用Talaromyces处理养猪废水时，COD、TP、氨氮去除率分别可达52.1%、21.5%、18.6%。这些也可能是土著菌剂A对黑臭水体污染物净化效果较佳的原因。

表5 属水平的真菌相对丰度Table 5 Relative abundance of fungus in genus level %

目前对于污水处理过程中真菌作用的机制研究尚少，很多真菌的具体功能尚不清楚[33]。然而，大量研究表明，真菌在污水处理中表现出极大的多样性，起着重要作用[34]。真菌在去除有毒化合物、提高脂质积累、改善生物转化[35-36]等方面具有重要作用，且其对重金属的抗性作用强于细菌[37]。因此对于污水处理过程中真菌的作用机制的研究具有重要意义，未来应扩大并深入开展真菌相关的研究。

3 结 论

(1) 对目标黑臭水体中氨氮、TP、COD的去除效果土著菌剂A优于工程菌剂B。

(2) 土著菌剂A可使具有污染物降解特性的功能微生物菌群发生群聚，强化功能微生物对污染物的降解；工程菌剂B可使细菌群落多样性及丰富度提高，但由于其对目标黑臭水体的适应性较差而净化作用较弱。

(3) 不同菌剂处理下，微生物群落结构具有显著差异。共有的优势物种相对丰度存在明显差异；细菌和真菌优势菌属及其相对丰度也不同。