张丽娟 吴唯维 李素一 陈 华 柯翎 林晨韬

（1.福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003；2.福建师范大学生命科学学院 福州 350007；3.福建师范大学南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心 福州 350117；4.福建师范大学福建省特色海洋生物资源可持续利用重点实验室 福州 350117）

抗菌肽（Antimicrobial peptide）是一类由生物机体产生的具有抑菌活性的阳离子多肽类物质， 是机体抵御病原菌感染的天然屏障之一。近年来，由于寻找抗生素替代物的迫切需求， 以及抗菌肽的抗菌活性高、抗菌谱广、种类多、目标菌株不易产生耐药突变等特点， 其作为一种潜在的抗生素替代物越来越受到研究者的重视[1-2]。

目前， 抗菌肽的获得方式主要是从生物体中提取、人工化学合成和构建基因工程菌大量表达。其中从生物体中提取只能获得少量抗菌肽，且操作复杂；人工化学合成抗菌肽成本高且与天然抗菌肽的结构有差异；而构建基因工程菌大量表达则具效率高、成本低且易操作等优点。 基因工程表达主要包括原核表达系统与真核表达系统， 其中酵母表达系统作为常用的真核表达系统， 表达的抗菌肽更接近天然状态， 并且操作简单、 无毒副作用、 利于纯化及工业化生产[3]。 Sun 等[4]利用毕赤酵母表达了融合蛋白抗菌肽乳铁蛋白-溶菌酶， 具有良好的稳定性。 Meng等[5]利用毕赤酵母重组表达的Hispidalin 具有广谱的抗菌活性， 并且具有广泛的热稳定性与酸碱稳定性。

我们前期从欧洲鳗鲡中发现一个新型抗菌肽elecilin，并对其进行了原核表达，证实其对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用（另文发表）。 本研究利用酵母表达系统， 获得了分泌到培养基中大量表达的elecilin， 为阐明其功能及其在生产实践中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 毕赤酵母X-33 和酵母分泌表达载体pPICZaA 由本实验室保存。 限制性内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ、Taq DNA polymerase、T4 DNA 连接酶、DNA ladder 购自TaKaRa 公司；抗生素Zeocin、抗体anti-His 单克隆抗体购自Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽的序列特征分析 根据欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin 基因编码的氨基酸序列， 利用BioEdit 软件预测蛋白质的疏水区和亲水区，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在线预测信号肽信息，https://swissmodel.expasy.org/interactive 在线预测蛋白的三级结构，PROSITE 数据库分析蛋白的活性区域。

1.2.2 基因序列合成与酵母分泌表达载体的构建为利于抗菌肽的表达， 根据获得的欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin 的基因序列，及酵母表达系统的密码子偏好性， 在不改变编码氨基酸序列的基础上合成去除信号肽的elecilin 基因序列，并在其上游与下游分别引入Xho Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点。 将合成的目的基因序列与Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切回收的pPICZaA 在T4 DNA 连接酶作用下进行连接，经鉴定后，获得质粒pPICZaA-elecilin。

1.2.3 酵母菌的电击转化和阳性转化子的PCR 筛选 按照电击转化步骤， 将质粒pPICZaA-elecilin转化至毕赤酵母X-33 感受态中。 转化后，均匀涂布于RDB 平板中，30 ℃培养3 d。 挑取若干单克隆酵母 菌， 用 引 物ɑ factor sequencing primer：TACTATTGCCAGCATTGCTGC 和 3' AOX primer：GCAAATGGCATTCTGACATCC 进行PCR 验证。

1.2.4 抗菌肽的诱导表达及SDS-PAGE 鉴定 选取鉴定为阳性的克隆菌接种至BMGY 培养基，28 ℃培养至OD600为3.0 后，700 g/min 离心5 min， 收集菌体，并用新鲜的BMMY 培养基重悬菌体，至OD600为1.0，28 ℃继续培养， 每隔24 h 添加甲醇溶液（100%） 至终浓度为1 %诱导蛋白表达， 诱导96 h后收集培养基， 用SDS-PAGE 鉴定抗菌肽表达情况。

1.2.5 表达产物的Western blot 鉴定 分泌蛋白经SDS-PAGE 电泳后， 电转移至PVDF 膜上， 半干转90 min 后，将PVDF 膜用封闭液封闭2 h，然后洗脱液PBST 洗脱4 次，每次5 min，将膜与一抗（His-tag单克隆抗体） 在室温孵育1～2 h 后， 洗脱液洗脱（4 次，每次5 min），然后将膜转移到二抗溶液（含有辣根过氧化物酶标记的马抗鼠IgG）中，室温孵育1～2 h， 接着洗脱液洗脱， 用ECL 显色系统显色，在BIO-RAD 中显色后拍照。

2 结 果

2.1 欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin 的基因序列特征分析欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin 基因序列全长477 bp，编码159 个氨基酸，理论分子量约为17.4 kDa（见图1）。信号肽分析发现， 前30 位氨基酸为信号肽区域；三维结构预测， 该蛋白在84-106 区间是一个活性区域，含有2 个抗菌肽标签特征序列。

图1 欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin 的基因序列

2.2 酵母分泌表达载体的构建与重组转化子的PCR 鉴定 合成的elecilin 基因序列与酵母分泌表达载体pPICZaA 连接后， 得到elecilin 的酵母表达质粒pPICZaA-elecilin。 将其电击转化至酵母菌X-33 中，在RDB 平板中培养3 d 后挑取单克隆，培养后， 用 引 物ɑ factor sequencing primer 和3' AOX primer 进行PCR 鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示阳性克隆菌株扩增出与目的基因大小一致的片段 （见图2）。 进一步的测序结果表明，elecilin 基因已成功整合到酵母基因组中， 将阳性转化子命名为X-33/pPICZaA-elecilin。

图2 重组菌株X-33/pPICZaA-elecilin 的PCR 鉴定

2.3 抗菌肽的诱导表达及鉴定 将重组酵母进行甲醇诱导培养，收集培养基进行SDS-PAGE 分析和Western 鉴定。 结果显示，培养基中检测到一个分子量约17 kDa 的蛋白表达（见图3）。 进一步根据表达产物携带6×His 标签的特点，利用抗His-tag 单克隆抗体进行Western blot 验证，在约17 kDa 处的蛋白与该抗体特异性结合（见图4），证明目的蛋白在酵母菌X-33 中成功表达。

3 讨 论

图4 Western blot 鉴定elecilin 的表达

迄今为止，已发现的抗菌肽超过3 000 种，其中动物源抗菌肽超过2 000 种。 虽然抗菌肽种类及数量在不断增多，但是被广泛应用的却很少，究其原因包括抗菌肽在机体内的代谢情况尚不清楚、 安全性评价体系尚不完善、抗菌肽的生产成本高等[6]。 在抗菌肽的研究中， 毕赤酵母表达系统因其操作简单、表达高效、 且活性高等特点被广泛用于抗菌肽的表达[7]。 本研究根据毕赤酵母密码子偏好性，在不改变elecilin 的编码氨基酸序列基础上，合成了去除信号肽的DNA 序列， 构建了真核表达质粒pPICZaAelecin，利用毕赤酵母X-33 进行了表达，用甲醇诱导表达，经SDS-PAGE 与Western blot 鉴定，成功在毕赤酵母中表达了elecilin。 在此基础上，我们将分析其抗菌谱，进一步研究其功能，评估其在水产和畜禽等领域的应用价值。