林能锋 陈立志 曾 红＊

(1.福建省农业科学院生物技术研究所 福州 350003；2.福建师范大学生命科学学院南方海洋研究院 福州 350007)

感染大黄鱼的纤毛虫主要有剌激隐核虫（Crypotocaryon irritans）、淀粉卵涡鞭虫和盾纤毛虫，是对大黄鱼人工养殖造成严重危害的一大类病原[1]。 曾有报道， 刺激隐核虫导致的平均发病率在30%～100%，局部死亡率也达到80%[2]。大黄鱼鱼苗感染淀粉卵涡鞭虫的死亡率可达75%～100% ，成鱼死亡率50%～70%[3-4]。 盾纤毛虫被认为是一种兼性的机会性寄生虫，常造成海水养殖动物的感染，在世界范围内对养殖鱼类造成严重的经济损失[5]。 贪食迈阿密虫（M. avidus）、海洋尾丝虫（Uronema marinum）和水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembus persalinus）是最常见的感染海水养殖动物的致病盾纤毛虫。近年来，由盾纤毛虫感染大黄鱼的病例发生率越来越高。 我们分离并保存了一株感染大黄鱼的盾纤毛虫， 经鉴定为贪食迈阿密虫（M. avidus）。

纤毛虫受生活环境中化学物质浓度梯度刺激的影响，能产生趋向性运动[6-7]。 鱼类致病纤毛虫的趋化特性可能与其对鱼体的侵染密切相关[8]。 而目前对于盾纤类纤毛虫对养殖鱼类的趋化性研究尚未见相关报道。 本研究通过研究贪食迈阿密虫对4 种海水养殖鱼类组织匀浆液的趋化性， 推测其可能的侵染路径，以加深对盾纤类纤毛虫致病性的理解。

1 材料和方法

1.1 贪食迈阿密虫 贪食迈阿密虫 （M. avidus）为本实验室保存的分离自患病大黄鱼虫株。 培养方法参照林能锋等[9]描述的方法，18 ℃培养2～3 d，虫体培养密度＞5 000 ind/mL。

1.2 鱼类组织匀浆的制备 大黄鱼、黄姑鱼和鲈鱼样品均采自宁德三都澳养殖渔排， 大菱鲆采自市售活体。 鱼活体状态下刮取体表黏液，加入10 倍量海水，摇匀，为体表黏液样品。鱼体尾静脉采血，血样置4 ℃过夜，6 000 r/min、4 ℃离心10 min， 取上清，为鱼血清样品。 其余组织匀浆液的制备如下： 解剖经冰浴麻醉的活鱼， 切取并称量相应组织样品于玻璃匀浆器内，向其中加入10 倍量的预冷海水，冰浴匀浆，匀浆液4 ℃、6 000 r/min 离心10 min，吸取上清放置4 ℃冰箱备用。

1.3 趋化性测试方法 趋化性试验参考邹峰等[10]的研究方法。将进行趋化试验的载玻片放置于湿盒中，18 ℃，趋化过程持续30 min 后进行虫体计数。 计数方法为：在液滴中加入体积比为8%的Lugol's 碘液，在光学显微镜（10×10）下计数液滴范围内的虫体。试验重复5 次。对照组以过滤海水替换组织匀浆液。

1.4 趋化率计算及数据分析 趋化率（chemotaxis index，CI）=试验组织匀浆液中虫体数量/虫体总数×100%。 试验数据用Microsoft Excel 软件进行统计学差异显著性分析（成对双样本T 检验）处理，分别用P＞0.05、0.01＜P＜0.05 和P＜0.01 来表示差异不显著、差异显著和差异极显著。 多重比较分析应用SPSS软件。

2 结果与分析

贪食迈阿密虫对大菱鲆不同组织匀浆液的趋化作用不同，贪食迈阿密虫对眼匀浆液的趋化率最高，对脑脊液的趋化性次之， 对表皮黏液及肌肉匀浆液（与空白海水对照相比）并无明显的趋化现象。 t 检验分析结果显示，贪食迈阿密虫对大菱鲆的眼、脑脊液、脑、肾、鳃、肝的匀浆液表现出强烈的趋化性（P＜0.01）；对表皮黏液及肌肉匀浆液并无明显的趋化现象（P＞0.05）。 见图1。

图1 贪食迈阿密虫对大菱鲆不同生物组织材料的趋化性

贪食迈阿密虫对大黄鱼的脑、 眼匀浆液和血清的趋化率高（P＜0.01），表现出强烈的趋化作用；对体表黏液及鳃匀浆液的趋化率较低，但差异显著（P＜0.05）；对肝、肌肉匀浆液的趋化率最低，趋化性差异不显著（P＞0.05）。 见图2。

图2 贪食迈阿密虫对大黄鱼不同生物组织材料的趋化性

贪食迈阿密虫对与大黄鱼同属于石首鱼科的黄姑鱼不同组织匀浆液的趋化试验结果见图3。 贪食迈阿密虫同样表现出对黄姑鱼脑脊液、脑、眼匀浆液的高趋化性（P＜0.01）；对黄姑鱼的肝、肾匀浆液亦表现出较高的趋化率（P＜0.05）；但对肌肉、鳃、黏液匀浆液无明显趋化现象（P＞0.05）。

图3 贪食迈阿密虫对黄姑鱼不同生物组织材料的趋化性

贪食迈阿密虫对鲈鱼的眼、脑、脑脊液匀浆液表现出极高的趋化率差异（P＜0.01），虫体表现出对上述组织匀浆液的强烈趋化性；对鲈鱼的体表黏液、肾的匀浆液也表现出较高的趋化率（P＜0.01）；而对鲈鱼的肌肉、鳃、肝匀浆液无明显趋化现象（P＞0.05）。见图4。

图4 贪食迈阿密虫对鲈鱼不同生物组织材料的趋化性

比较贪食迈阿密虫对4 种养殖鱼类组织匀浆的趋化性，贪食迈阿密虫表现出对大菱鲆、大黄鱼的组织匀浆趋化性相对高于黄姑鱼、鲈鱼，尤其是贪食迈阿密虫对大菱鲆、大黄鱼的眼和脑组织的趋化性上，其数据结果都显著大于黄姑鱼和鲈鱼， 应用SPSS软件进行多重比较分析， 结果表现为极显著差异（P＜0.01）。

3 讨 论

贪食迈阿密虫对4 种养殖鱼类： 大菱鲆、 大黄鱼、黄姑鱼、鲈鱼的眼、脑匀浆液及脑脊液表现出强烈的趋化效果，而对鳃、肝、黏液、肌肉、肾脏匀浆液的趋化率较低， 显然贪食迈阿密虫表现出对本试验中多种鱼类的神经组织具有显著的趋化偏好性，而对各种鱼类的内脏组织匀浆液的趋化偏好性不明显。 在由贪食迈阿密虫导致的大黄鱼死亡病例中，可在眼及脑中分离到大量盾纤虫的存在， 患鱼也明显表现出游泳的无方向性， 这也与患鱼的神经系统受到侵染有关。 而对斑马鲨（Stegostoma fasciatum）[11]及豹鲨（Triakis semifasciata）[12]流行病学的研究中也证实，贪食迈阿密虫可引起脑膜脑炎，对鱼体的脑、鳃、肝进行SSU rRNA 基因的PCR 反应，显示只有脑组织有阳性结果，从该基因扩增出的DNA 序列与贪食迈阿密虫的DNA 序列完全匹配，这与本试验中贪食迈阿密虫对神经组织的趋化偏好性结果相吻合。 由于贪食迈阿密虫侵染后期感染养殖鱼类神经系统，造成鱼的游泳、摄食等重要生理活动失调。

在贪食迈阿密虫对鱼类侵染途径的研究中，发现盾纤虫不仅可以通过血液循环和结缔组织传播[13-14]，还可以通过神经系统或脑脊液循环传播[15]。从本研究的趋化性试验观察中得知， 神经组织匀浆液与肝、肾、肌肉的匀浆液相比具有更强的趋化诱导性， 从另一方面证实贪食迈阿密虫对中枢神经系统感染强于内脏组织器官的感染， 从而导致感染鱼类的快速死亡。

贪食迈阿密虫对大黄鱼的血清也具有较高的趋化率，亦可解释破鳞片、皮肤受损的鱼更易受到感染的原因。 从不同鱼类组织匀浆对贪食迈阿密虫的趋化诱导性比较来看， 推测贪食迈阿密虫对宿主的侵染有一定的选择性。